Συμβολή στη μελέτη της ανοσοπαθογένειας της αποφολιδωτικής δερματίτιδας της λεϊσμανίωσης του σκύλου (Leishmania infantum)

Abstract

Canine leishmaniosis (CL), caused by the intracellular protozoon L. infantum, is perhaps the most common infectious disease in Greece. Although recently a lot of research has been carried out on the immunopathogenesis of CL, there is still lack of information on the relevant immune mechanisms pertaining exfoliative dermatitis (ED), which is the most common cutaneous manifestation of the disease. Consequently, the aim of the present study was the cellular immunophenotyping of ED in association with its histopathology, in an attempt to throw more light on its immunopathogenesis. The study included a total of 48 natural cases of CL, the diagnosis of which, apart from the history, clinical picture and clinicopathological findings, was confirmed by the detection of amastigotes on direct smears made from lymph node or bone marrow aspirates, coupled with positive IFA and/or ELISA serology. For the design of the study, the affected animals were allocated into 3 groups. Group A included 26 symptomatic dogs with ED while group B included the same animals, though fewer by two (n: 24), from which only normally looking skin was biopsized. Group C included 22 symptomatic dogs, which did not show skin lesions reminiscent of ED. Moreover, 22 clinically healthy dogs that had been tested negative for CL were used as controls (group D). In group C and D animals, 8mm punch biopsies were obtained from the lateral thoracic wall, as it was also the case in group A, provided that ED lesions were present at that body site; otherwise, the biopsies were taken from the closest sites exhibiting ED lesions (group A) or no lesions at all (group B). Half of the biopsy was fixed in 10% buffered formalin, paraffin embedded, cut and stained with H and E (histopathological examination, detection of L. infantum amastigotes) or with the avidin-biotin-peroxidase complex immunohistochemical method (examination for CD3, CD45RA, detection of L. infantum amastigotes). The other half was deep frozen, cut and immunostained with the same method for the detection of CD4, CD8α, CD8β, CD21 and MHC-II positive cells. A polyclonal rabbit antibody against human CD3 and monoclonal mouse antibodies against canine CD4, CD45RA, CD8α, CD8β, CD21 and MHC-II molecules were used. Cell counting was focused on 10 HPF (x400) of the epidermis, 20 of the dermis and 10 dermal sites exhibiting sebaceous adenitis, all selected at random. The immunocytes were objectively counted with the aid of a computerized system. Clinically, the ED lesions were multifocal (92.3%) or diffuse (7.7%) with symmetrical distribution (92.3%). They were mainly localized on the head (96.2%), the dorsal aspect of body trunk (96.2%), pinnae (80.8%) and hind limbs (73.1%) and characterized mainly by hypotrichosis-alopecia, bran or asbestos-like profuse scaling and dryness of the skin. In general, the hair coat of the affected dogs appeared dry, brittle and lusterless. A total of 61.5% and 27.3% of group A and C dogs, respectively, also bore other CL-compatible lesions.

Η λεϊσμανίωση (ΛΣ), που οφείλεται στο ενδοκυτταρικό πρωτόζωο Leishmania infantum, είναι ίσως το συχνότερο λοιμώδες νόσημα του σκύλου στην Ελλάδα. Ενώ τα τελευταία χρόνια έχει υπάρξει σημαντική πρόοδος πάνω στη διερεύνηση αρκετών σημείων της ανοσοπαθογένειας της ΛΣ δεν έχουν γίνει, απ’ ό,τι τουλάχιστον γνωρίζουμε, σχετικές μελέτες πάνω στην αποφολιδωτική δερματίτιδα (ΑΔ) που αναμφίβολα αποτελεί το συχνότερο είδος δερματικών αλλοιώσεων της νόσου. Σκοπός, λοιπόν, της έρευνας αυτής ήταν να μελετηθούν η ιστολογική εικόνα και οι διάφοροι κυτταρικοί πληθυσμοί του ανοσοποιητικού συστήματος που συμμετέχουν στο φλεγμονικό διήθημα της ΑΔ σε μία προσπάθεια να ριχτεί περισσότερο φως πάνω στην ανοσοπαθογένεια, όχι μόνο των σχετικών δερματικών αλλοιώσεων, αλλά και της νόσου γενικότερα. Η μελέτη περιλάμβανε 48 συνολικά σκύλους με συμπτωματική λεϊσμανίωση, η διάγνωση της οποίας, εκτός από το ιστορικό, την κλινική εικόνα, και τα εργαστηριακά ευρήματα, στηρίχτηκε βασικά στην ανεύρεση των αμαστιγωτών μορφών του παρασίτου στα επιχρίσματα από οπό λεμφογαγγλίου ή/και μυελό των οστών καθώς και στο θετικό τίτλο των ειδικών IgG αντισωμάτων με τις ορολογικές εξετάσεις IFA και ELISA. Επιπλέον, χρησιμοποιήθηκαν και 22 κλινικά υγιείς σκύλοι ως μάρτυρες. Για το σκοπό της μελέτης το σύνολο των 70 αυτών ζώων χωρίστηκε σε 4 ομάδες. Συγκεκριμένα, η ομάδα Α περιλάμβανε 26 σκύλους με ΑΔ, η ομάδα Β περιλάμβανε τα ίδια ζώα με εκείνα της Α, εκτός από δύο (n:24), με το ενδιαφέρον να επικεντρώνεται στο φυσιολογικής όψης δέρμα, η Γ περιλάμβανε 22 σκύλους με συμπτωματική ΛΣ, χωρίς όμως αλλοιώσεις ΑΔ, ενώ η ομάδα Δ περιλάμβανε τα 22 κλινικά υγιή και αρνητικά στην L. infantum ζώα. Στα ζώα των ομάδων Γ και Δ οι βιοψίες πάρθηκαν από την πλάγια επιφάνεια του θώρακα, όπως εξάλλου και σ’ εκείνα της ομάδας Α εφόσον υπήρχαν αλλοιώσεις ΑΔ στην περιοχή αυτή. Σε αντίθετη περίπτωση, οι βιοψίες λαμβάνονταν από τα πλησιέστερα σημεία με αλλοιώσεις ΑΔ ενώ στην ομάδα Β επιλέγονταν η πλησιέστερη περιοχή στην οποία το δέρμα εμφανιζόταν φυσιολογικό. Το μισό ιστοτεμάχιο κάθε βιοψίας μονιμοποιούνταν σε διάλυμα φορμόλης 10%, εγκλείονταν σε παραφίνη, κοβόταν και βαφόταν με αιματοξυλίνη-εωσίνη (ιστοπαθολογική εξέταση, ανίχνευση αμαστιγωτών μορφών L.infantum) και με την ανοσοϊστοχημική μέθοδο της αβιδίνης-βιοτίνης-συμπλέγματος υπεροξειδάσης (εξέταση για CD3, CD45RA, ανίχνευση αμαστιγωτών μορφών L.infantum). Το άλλο μισό ιστοτεμάχιο καταψυχόταν, κοβόταν και βαφόταν με την παραπάνω ανοσοϊστοχημική μέθοδο προκειμένου να ανιχνευτούν τα θετικά βαμμένα για τα αντιγόνα CD4, CD8α, CD8β, CD21 και MHC-II κύτταρα. Για το σκοπό αυτό, χρησιμοποιήθηκαν το πολυκλωνικό αντίσωμα κουνελιού κατά του CD3 του ανθρώπου και τα μονοκλωνικά αντισώματα ποντικού κατά των CD4, CD45RA, CD8α, CD8β, CD21 και MHC-II του σκύλου. Η μικροσκοπική καταμέτρηση των κυττάρων του ανοσοποιητικού συστήματος γινόταν με τη βοήθεια ηλεκτρονικού υπολογιστή σε 10 οπτικά πεδία (x400) για την επιδερμίδα, σε 20 για το χόριο και σε 10 για τις περιοχές εκείνες του χορίου στις οποίες παρατηρούνταν σμηγματαδενίτιδα.