Διερεύνηση της γενετικής δομής τριών ειδών του γένους Trachurus με τη χρήση DNA δεικτών

Abstract

The purpose of the present doctoral thesis is the genetic identification and the investigation of the phylogenetic relationships and the population structure of three Trachurus species present in European waters: T. trachurus, T. mediterraneus and T. picturatus. Samples were obtained from three different regions of Greece, from W. Italy and East Spain. In the analysis, samples from six different areas of the Atlantic Sea were also included. Both mitochondrial and nuclear genes were examined. The sequence of a segment of the cytochrome b gene of mtDNA was determined for 84 individuals that cover a large scale of the distribution of the three Trachurus species. The sequence analysis revealed 22 different haplotypes in total after the analysis of 26 individuals of T. mediterraneus, 30 individuals of T. trachurus and 28 individuals of T. picturatus. The results revealed the existence of 8 species-specific positions which discriminate T. trachurus from T. mediterraneus, 6 species-specific diagnostic positions, which distinguish T. trachurus from T. picturatus and T. mediterraneus is distinguished from T. picturatus by 4 species-specific diagnostic positions. The results of the sequence analysis of cytochrome b of all the three species were compared to define different restriction sites that could generate species-specific restriction patterns. Two useful endonucleases (NlaIII and NciI) were found for the discrimination of T. trachurus from the other two species and one enzyme (BsmAI) for the discrimination of T. Mediterraneus. According to the results obtained after screening a large number of individuals (239), the PCR-RFLP analysis developed here could lead to the accurate identification of the three Trachurus species with success ranging from 100% for NlaIII and NciI to 97% for BsmAI. Thus, the PCR-RFLP analysis of the cytochrome b of mtDNA provides an alternative, simpler and faster approach for species identification than sequence analysis that is expensive and time consuming. SSCP was also used for the discrimination of species with eggs similar to horse mackerel eggs. Electrophoresis of cytochrome b revealed a different electophoretic mobility of fragments of T. trachurus when compared to T. mediterraneus and T. picturatus. On the contrary, SSCP profiles were sometimes identical between T. mediterraneus and T.picturatus although previous sequence analysis revealed that the two species have distinct DNA sequences.

Αντικείμενο της συγκεκριμένης διατριβής αποτελεί η γενετική ταυτοποίηση καθώς και η μελέτη των φυλογενετικών σχέσεων και της πληθυσμιακής δομής των τριών ειδών του γένους Trachurus που αφθονούν στα Ευρωπαϊκά ύδατα: T. trachurus, T. mediterraneus and T. picturatus. Στην εργασία αυτή συλλέχθηκαν δείγματα από τρεις περιοχές της Ελλάδας, από τη δυτική Ιταλία και από την ανατολική Ισπανία. Επίσης, στις αναλύσεις που πραγματοποιήθηκαν, μελετήθηκαν και δείγματα από έξι διαφορετικές περιοχές του Ατλαντικού. Eξετάστηκαν τόσο μιτοχονδριακές όσο και πυρηνικές ακολουθίες DNA. Έτσι, προσδιορίστηκε η πρωτοταγής δομή τμήματος του κυτοχρώματος b του mtDNA για συνολικά 84 άτομα και των τριών ειδών του γένους Trachurus. Προσδιορίστηκαν συνολικά 22 διαφορετικοί απλότυποι ύστερα από την ανάλυση 26 δειγμάτων T. mediterraneus, 30 T. trachurus και 28 T. picturatus. Η ανάλυση αποκάλυψε την ύπαρξη 8 ειδο-ειδικών θέσεων που επιτρέπουν τη διάκριση του T. trachurus από το T. mediterraneus, 6 ειδο-ειδικών θέσεων, που επιτρέπουν τη διάκριση του T. trachurus από το T. picturatus, ενώ το T. mediterraneus διακρίνεται από το T. picturatus με 4 ειδο-ειδικές θέσεις. Από τη σύγκριση των ακολουθιών του κυτοχρώματος b βρέθηκαν δύο ενδονουκλεάσες περιορισμού (NlaIII and NciI) ικανές να διακρίνουν το T. trachurus από τα άλλα δύο είδη και ένα ένζυμο ικανό (BsmAI) να διακρίνει το T. mediterraneus. Με βάση τα αποτελέσματα από την ανάλυση 239 ατόμων και των τριών ειδών με τις τρεις ενδονουκλεάσες περιορισμού, προκύπτει ότι η μεθοδολογία PCR-RFLP που αναπτύχθηκε επιτρέπει την ακριβή ταυτοποίηση των ειδών του Trachurus με ποσοστό επιτυχίας 100% για τα ένζυμα NlaIII και NciI και μέχρι 97% για το BsmAI. Έτσι, η ανάλυση PCR-RFLP του κυτοχρώματος b του mtDNA παρέχει μια γρήγορη, απλή και φθηνή μεθοδολογία για την ταυτοποίηση ειδών σε σχέση με την ανάλυση της πρωτοταγούς δομής που είναι ακριβή και χρονοβόρα διαδικασία. Η μεθοδολογία της SSCP, επίσης, δοκιμάστηκε για τη διάκριση των τριών ειδών του γένους Trachurus. Η ηλεκτροφορετική ανάλυση του κυτοχρώματος b αποκάλυψε διαφορετική ηλεκτροφορετική κινητικότητα του T. trachurus σε σχέση με τα άλλα δύο είδη. Αντίθετα, τα ηλεκροφορετικά πρότυπα του T. mediterraneus και του T. picturatus ήταν αρκετά όμοια μεταξύ τους. Έτσι, η μεθοδολογία αυτή είναι ικανή να διακρίνει με ένα