Ενδοκυτταρικοί μηχανισμοί μεταγωγής μηνυμάτων στην καρδιά αρουραίου

Abstract

In cardiac cells, responses to a1-adrenergic stimuli include rapid changes in contractility, in metabolic responses or in electrophysiological properties. α1- Adrenergic stimulation may also lead to long-term maintenance of cardiac function trough regulation of gene expression and cell growth. As a first step we have used the α1D selective antagonist, BMY 7378, to investigate the presence of α1D-adrenoceptor subtype in adult rat heart by radioligand binding assays. BMY 7378 inhibited [3H]prazosin binding to cardiac membranes in a biphasic mode with a pKi of 9.19±0.26 for high affinity sites and 6.92±0.09 for low affinity sites. We also determined the role of this subtype in stimulating phosphoinositide (PtdIns) hydrolysis in cardiac myocytes. The inhibition of the adrenaline - induced stimulation of PtdIns hydrolysis by BMY 7378 fitted a one-side model and the calculated pKb value (6.92±0.92) was consistent with the involvement of α1A and α1B adrenoceptors. Furthermore, BMY 7378, at concentrations up to100 nM, did not significantly affect the concentration-response curves for the adrenaline-induced stimulation of PtdIns hydrolysis. Taken together, these data suggest that α1Dadrenoceptors are expressed in adult rat heart but this subtype is not involved in the adrenaline induced stimulation of PtdIns hydrolysis. In other series of experiments we studied the effects of increased Ca2+ influx on α1- adrenoceptor stimulated InsP formation in cardiac myocytes. [3H]InsP responses to adrenaline were dependent on extracellular Ca2+ concentration, from 0.1μΜ to 2mM, and were completely blocked by Ca2+ removal. However, in cardiac myocytes preloaded with BAPTA, a highly selective chelating agent, Ca2+ higher than 1 μΜ had no effect on adrenaline stimulated [3H]InsP formation. Furthermore, ionomycin, a calcium ionophore, stimulated [3H]InsP formation. This response was additive with the response to adrenaline stimulation implying that different signaling mechanisms may be involved. The above data suggest that [3H]InsP formation induced by α1- adrenergic stimulation is in part mediated by increased Ca2+ influx. We further examined if such effects could be mediated through a specific α1- adrenoceptor subtype. In cardiac myocytes treated with the α1B-adrenoceptor alkylating agent, CEC, [3H]InsP formation remained unaffected by increased Ca2+ concentrations, a pattern similar to that observed when intracellular Ca2+ was chelated 162 with BAPTA. In contrast, addition of the α1A-subtype specific antagonist, 5΄- methylurapidil, did not affect the Ca2+ dependence of [3H]InsP formation. Neither nifedipine, a voltage-dependent Ca2+ channel blocker nor the inorganic Ca2+ channel blockers. Ni2+ and Co2+, had any effect on adrenaline stimulated [3H]InsP formation, at concentrations that inhibit Ca2+ channels. These data suggest that in cardiac myocytes, in addition to G-protein mediated response, α1-adrenergic stimulated [3H]InsP formation is activated by increased Ca2+ influx mediated by the α1B-subtype. We also investigated the role of α1-adrenoceptors in adaptive mechanisms that protect the heart during prolonged ischemia. Rat isolated perfused hearts treated for 5 min with α1-adrenergic agonist phenylephrine, before being subjected to prolonged ischemia, had improved functional recovery during reperfusion as well as reduced infarct area. Treatment with α1-specific antagonist, prazosin, abolished the protective effects of phenylephrine. Furthermore protection afforded by phenylephrine was attenuated in hearts treated with α1B-adrenoceptor selective antagonist CEC, but not in those treated with the α1A-adrenoceptor selective antagonist 5΄-methylurapidil. In addition treatment with low concentrations of methoxamine, considered to be α1Aadrenoceptor selective , did not confer any protection to the ischemic myocardium. These data suggest that stimulation of the α1B- but not the α1A-adrenoceptor subtype is responsible for the catecholamine-induced protection of ischaemic myocardium in rat.

Η ενεργοποίηση των α1-αδρενεργικών υποδοχέων προκαλεί , μέσω της κινητοποίησης των αντίστοιχων μονοπατιών μεταγωγής μηνύματος, ποικίλες φυσιολογικές αντιδράσεις που σχετίζονται με τη συσταλτότητα, τον κυτταρικό μεταβολισμό, την έκφραση συγκεκριμένων γονιδίων και την κυτταρική αύξηση. Η αναγνώριση και ταυτοποίηση τριών διαφορετικών υποτύπων (α1Α, α1Β και α1D) δημιούργησε, όπως ήταν φυσικό, ερωτήματα σχετικά με το είδος των α1- αδρενεργικών υποδοχέων που εκφράζονται στη καρδιά και τους ακριβείς σηματοδοτικούς μηχανισμούς μέσω των οποίων εκδηλώνουν τη δράση τους. Στο πρώτο στάδιο της μελέτης διερευνήθηκε η ύπαρξη των α1D υποτύπων τβν αδρενεργικών υποδοχέων στα καρδιακά κύτταρα. Για το σκοπό αυτό έγιναν πειράματα ανταγωνιστικής σύνδεσης της [3Η]πραζοσίνης, ειδικού ανταγωνιστή των α1-αδρενεργικών υποδοχέων, σε παρασκευάσματα κυτταρικών μεμβρανών παρουσία του ειδικού ανταγωνιστή των α1D-αδρενεργικών υποδοχέων ΒΜΥ 7378. Η σύνδεση της [3Η]πραζοσίνης ανεστάλη από το ΒΜΥ 7378 κατά τρόπο που συμφωνούσε με την ύπαρξη ειδικών μεμβρανικών θέσεων σύνδεσης με υψηλή συγγένεια για το ΒΜΥ 7378 (διφασική καμπύλη αναστολής, pKi , 9.19±0.26 για τις θέσεις υψηλής συγγένειας και 6.64±0.09 για τις θέσεις χαμηλής συγγένειας). Στις μεμβράνες των καρδιακών κυττάρων το ποσοστό των θέσεων υψηλής συγγένειας για το ΒΜΥ 7378 ανέρχεται στο 30 % περίπου του συνολικού πληθυσμού των θέσεων της [3Η]πραζοσίνης. Μελετήθηκε επίσης η σχέση των α1D- υποτύπων που ανιχνεύθηκαν στην καρδιά με την ενεργοποίηση του μονοπατιού υδρόλυσης των μεμβρανικών φωσφολιπιδίων (PtdIns). Η επαγόμενη από την αδρεναλίνη υδρόλυση των PtdIns, σε απομονωμένα καρδιακά κύτταρα, ανεστάλη από το ΒΜΥ 7378. Η μη γραμμική ανάλυση παλινδρόμησης της αναστολής σχηματισμού InsPs από το ΒΜΥ 7378 έδειξε σημαντικά καλύτερη προσαρμογή στο πρότυπο ενός μόνο τύπου υποδοχέων (μονοφασική καμπύλη αναστολής, pKb 6.92±0.28). Η τιμή της pKb είναι παρόμοια με την τιμή της pKi για τις θέσεις χαμηλής συγγένειας στα πειράματα σύνδεσης (6.64±0.09). Επιπλέον, η ανασταλτική επίδραση του ΒΜΥ 7378, στις καμπύλες συγκέντρωσης-απόκρισης των μυοκυττάρων σε αυξανόμενες συγκεντρώσεις αδρεναλίνης, δεν ήταν σημαντική σε συγκεντρώσεις που κυμαίνονται στα επίπεδα της Κd που προσδιορίστηκε στα πειράματα ανταγωνιστικής σύνδεσης με [3Η]πραζοσίνη. 159 Φαίνεται ότι στην υδρόλυση των PtdIns συμμετέχουν μόνο οι υποτύποι των α1- αδρενεργικών υποδοχέων που έχουν χαμηλή συγγένεια για το ΒΜΥ 7378 (α1Α και α1Β). Στο δεύτερο στάδιο της μελέτης εξετάστηκε η συμμετοχή των ιόντων Ca2+ στο μονοπάτι υδρόλυσης των μεμβρανικών PtdIns που ενεργοποιείται από τους α1- αδρενεργικούς υποδοχείς, στα καρδιακά κύτταρα. Η παραγωγή [3Η]InsPs που επάγει η αδρεναλίνη σε απομονωμένα μυοκύτταρα εξαρτάται από την συγκέντρωση του εξωκυτταρικού ασβεστίου, όταν κυμαίνεται από 0.1μΜ έως 2mΜ. Η πλήρης απομάκρυνση του εξωκυτταρικού ασβεστίου αναστέλλει το σχηματισμό [3Η]InsPs που επάγεται από την αδρεναλίνη. Η ρύθμιση της ενδοκυτταρικής συγκέντρωσης ασβεστίου (περίπου στα 0.152 nM) με τον χηλικό παράγοντα BAPTA (ύστερα από την επώασή των κυττάρων με την εστερική μορφή της ένωσης, ΒΑΡΤΑ-ΑΜ) μετέβαλλε το πρότυπο της επαγόμενης παραγωγής [3Η]InsPs σε διαφορετικές συγκεντρώσεις εξωκυτταρικού ασβεστίου. Στα κύτταρα αυτά, αύξηση της συγκέντρωσης Ca2+ πάνω από 1μΜ δεν επηρέασε το ρυθμό παραγωγής [3Η]InsPs που επάγεται από την αδρεναλίνη. Φαίνεται ότι ο σχηματισμός [3Η]InsPs στα καρδιακά κύτταρα, ύστερα από α1-αδρενεργική διέγερση με αδρεναλίνη, εξαρτάται ως ένα βαθμό από την εισροή ιόντων Ca2+. Παράλληλα, η ιονοφόρος ένωση ιονομυκίνη προκάλεσε την παραγωγή [3Η]InsPs. Η δράση της ιονομυκίνης ήταν προσθετική στην απόκριση που επάγει η α1-αδρενεργική διέγερση. Εξετάστηκε επίσης αν η εισροή ιόντων Ca2+ σχετίζεται με την υδρόλυση των PtdIns μέσω ενός συγκεκριμένου υποτύπου των α1-αδρενεργικών υποδοχέων. Σε καρδιακά κύτταρα που επωάστηκαν με τον ειδικό αναστολέα των α1Β υποδοχέων CEC η επαγόμενη, από την αδρεναλίνη, παραγωγή [3Η]InsPs ακολούθησε παρόμοιο πρότυπο, σε σχέση με την εξωκυτταρική συγκέντρωση ασβεστίου, με αυτό που παρατηρήθηκε στα κύτταρα που φορτίστηκαν ενδοκυτταρικά με ΒΑΡΤΑ. Αντίθετα ο α1Α ειδικός ανταγωνιστής 5΄-μεθυλουραπιδίλη δεν επηρέασε την επαγομένη παραγωγή [3Η]InsPs που παρατηρείται κατά την επώαση των