Σύνθεση και βιολογική δράση αναλόγων της GnRH (Gonadotropin Releasing Hormone), με υποκατάσταση στις θέσεις 5,6,9: εφαρμογές στην αναπαραγωγή

Abstract

In the present study 33 peptides analogues were synthesized on the basis of mGnRH or LHRH with variant amino acid residues in positions 5, 6, 9, 10 aiming to study their biological activity and the possibility of their use at the fish hatcheries. Based on the bibliography and conformational studies of the molecule of GnRH using 2D-NMR spectroscopy techniques the following analogues were designed and synthesized. 1. [Tyr(OMe)5]GnRH 2. [Tyr(OMe)5, Aibu6]GnRH 3. [Tyr(OMe)5, D-His(tCl)6]GnRH 4. [Tyr(OMe)5, Aibu6, Pro9NHEt]GnRH 5. [Tyr(OMe)5, D-His(tCl)6, Pro9NHEt]GnRH 6. [Tyr(OMe)5, Aibu6, Pro9NHEtOH]GnRH 7. [Tyr(OMe)5, Aibu6, Aze9]GnRH 8. [Tyr(OMe)5, D-Lys6, Aze9]GnRH 9. [Tyr(OMe)5, D-Arg6, Aze9]GnRH 10. [Tyr(OMe)5, D-Glu6, Aze9]GnRH 11. [Tyr(OMe)5, D-Asp6, Aze9]GnRH 12. [Tyr(OMe)5, D-Ser6, Aze9]GnRH 13. [Tyr(OMe)5, D-Thr6, Aze9]GnRH 14. [Tyr(OMe)5, D-Tyr6, Aze9]GnRH 15. [Tyr(OMe)5, D-Arg(Tos)6, Aze9]GnRH 16. [Tyr(OMe)5, D-Asp(Bzl)6, Aze9]GnRH 17. [Tyr(OMe)5, Aibu6, Aze9NHEt]GnRH 18. [Tyr(OMe)5, D-Lys6, Aze9NHet]GnRH 19. [Tyr(OMe)5, D-Arg6, Aze9NHEt]GnRH 20. [Tyr(OMe)5, D-Glu6, Aze9NHEt]GnRH 21. [Tyr(OMe)5, D-Asp6, Aze9NHEt]GnRH 22. [Tyr(OMe)5, D-Ser6, Aze9NHEt]GnRH 23. [Tyr(OMe)5, D-Thr6, Aze9Het]GnRH 24. [Tyr(OMe)5, D-Tyr6, Aze9NHEt]GnRH 25. [Tyr(OMe)5, D-Arg(Tos)6, Aze9Het]GnRH 26. [Tyr(OMe)5, D-Asp(OMe)6, Aze9NHEt]GnRH 27. [Tyr(OMe)5, Aze9NHEtOH]GnRH 28. [Tyr(OMe)5, D-Glu6, Aze9NHEtOH]GnRH 29. [Tyr(OMe)5, D-Arg6, Aze9NHEtOH]GnRH 30. Cyclo (4,9)[Lys4, D-Trp6, Glu9]GnRH 31. Cyclo (4,9)[D-Phe2, Lys4, D-Trp6, Glu9]GnRH 32. [Tyr(OMe)5, Aze9]GnRH 33. [Tyr(OMe)5, Aze9NHEt]GnRH. The peptides were synthesized by SPPS using the acid sensitive 2-Cl-trityl-Cl resin, which is compatible with N-Fmoc protected amino acids and DCC/HOBt as coupling reagents. In cases of C-terminal amides, the resin was used esterified with the linker Rink-Bematowitz. The mild acidic conditions for peptide-resin cleavage afforded properly protected peptides from which the final products were obtained after deprotection. The so synthesized analogues were purified by semi-preparative RP-HPLC, identified by RP-HPLC, FAB-MS and AA. From the study of the NMR experiments we concluded that the molecule of GnRH has a cyclic conformation and there is a cluster between the 3 amino acids Tyr / Trp / His of the molecule. The peptides biological activity included experiments in vivo and in vitro of 4 categories of biological models. 1. Agonist or antagonist activity of the analogues using goldfish pituitaries in variant concentrations of the peptide. 2. Binding affinity of the analogues in the GnRH receptor of a mammal. Rat pituitary was used. 3. In vivo experiment in fish hatcheries with Mediterranean species (sea-bass, mullet, labret). 4. Peptides activity in cancer cell lines using breast and ovary human cancer cells. From the results of the experiments we concluded that some of the synthesized peptides were agonists with use in inducing breeding at the fish hatcheries and good results concerning the human reproduction and cancer therapy.

Στην παρούσα διατριβή συντέθηκαν 33 πεπτιδικά ανάλογα της εκλυτικής ορμόνης των γοναδοτροπινών mGnRH ή LHRH με αλλαγές στις θέσεις 5, 6, 9, 10 με σκοπό την μελέτη της βιολογικής τους δράσης και την δυνατότητα χρησιμοποίησης τους στις ιχθυοκαλλιέργειες. Με βάση τα δεδομένα της βιβλιογραφίας και της μελέτης της διαμόρφωσης αναλογών της GnRH με την χρήση τεχνικών φασματοσκοπίας 2D-NMR σχεδιάστηκαν και συντέθηκαν τα παρακάτω ανάλογα (εννεαπεπτίδια και δεκαπεπτίδια). 1. [Tyr(OMe)5]GnRH 2. [Tyr(OMe)5, Aibu6]GnRH 3. [Tyr(OMe)5, D-His(tCl)6]GnRH 4 .[Tyr(OMe)5, Aibu6, Pro9NHEt]GnRH 5. [Tyr(OMe)5, D-His(tCl)6, Pro9NHEt]GnRH 6. [Tyr(OMe)5, Aibu6, Pro9NHEtOH]GnRH 7. [Tyr(OMe)5, Aibu6, Aze9]GnRH 8. [Tyr(OMe)5, D-Lys6, Aze9]GnRH 9. [Tyr(OMe)5, D-Arg6, Aze9]GnRH 10. [Tyr(OMe)5, D-Glu6, Aze9]GnRH 11. [Tyr(OMe)5, D-Asp6, Aze9]GnRH 12. [Tyr(OMe)5, D-Ser6, Aze9]GnRH 13. [Tyr(OMe)5, D-Thr6, Aze9]GnRH 14. [Tyr(OMe)5, D-Tyr6, Aze9]GnRH 15. [Tyr(OMe)5, D-Arg(Tos)6, Aze9]GnRH 16. [Tyr(OMe)5, D-Asp(Bzl)6, Aze9]GnRH 17. [Tyr(OMe)5, Aibu6, Aze9NHEt]GnRH 18. [Tyr(OMe)5, D-Lys6, Aze9NHet]GnRH 19. [Tyr(OMe)5, D-Arg6, Aze9NHEt]GnRH 20. [Tyr(OMe)5, D-Glu6, Aze9NHEt]GnRH 21. [Tyr(OMe)5, D-Asp6, Aze9NHEt]GnRH 22. [Tyr(OMe)5, D-Ser6, Aze9NHEt]GnRH 23. [Tyr(OMe)5, D-Thr6, Aze9Het]GnRH 24. [Tyr(OMe)5, D-Tyr6, Aze9NHEt]GnRH 25. [Tyr(OMe)5, D-Arg(Tos)6, Aze9Het]GnRH 26. [Tyr(OMe)5, D-Asp(OMe)6, Aze9NHEt]GnRH 27. [Tyr(OMe)5, Aze9NHEtOH]GnRH 28. [Tyr(OMe)5, D-Glu6, Aze9NHEtOH]GnRH 29. [Tyr(OMe)5, D-Arg6, Aze9NHEtOH]GnRH 30. Cyclo (4,9)[Lys4, D-Trp6, Glu9]GnRH 31. Cyclo (4,9)[D-Phe2, Lys4, D-Trp6, Glu9]GnRH 32. [Tyr(OMe)5, Aze9]GnRH 33. [Tyr(OMe)5, Aze9NHEt]GnRH. Η σύνθεση των πεπτιδίων έγινε σε στερεή φάση επί της 2-χλωροτριτυλοχλωρίδιο ρητίνης η οποία συνδυάζεται με την χρήση N-Fmoc προστατευμένων αμινοξέων και DCC/HOBt ως αντιδραστήρια σύζευξης. Στην περίπτωση των C-τελικών αμιδίων χρησιμοποιήθηκε η ίδια ρητίνη εστεροποιημένη με τον συνδέτη (Linker) των Rink- Bernatowitz. Οι ήπιες συνθήκες αποκοπής των πεπτιδίων από την ρητίνη έδωσαν κατάλληλα προστατευμένα πεπτίδια τα οποία έδωσαν με απομάκρυνση των προστατευτικών ομάδων τα τελικά προϊόντα. Ο καθαρισμός των πεπτιδίων έγινε με ημιπαρασκευαστικό RP-HPLC και η ταυτοποίηση τους με αναλυτικό RP-HPLC, FAB-MS και ανάλυση αμινοξέων. Από την μελέτη την NMR πειραμάτων προέκυψε για την διαμόρφωση του πεπτιδίου της GnRH ότι το μόριο έχει κυκλική διαμόρφωση και υπάρχει αλληλεπίδραση τριών αμινοξέων των Tyr / Trp / His τα οποία σχηματίζουν στο χώρο δακτύλιο. Η μελέτη της βιολογικής δράσης των πεπτιδίων έγινε σε 4 κατηγορίες βιολογικών μοντέλων και περιελάμβαναν πειράματα in vivo και in vitro. 1. Έλεγχος δραστικότητας των αναλογών και επιβεβαίωση αγωνιστικής ή ανταγωνιστικής δράσης. Χρησιμοποιήθηκαν τμήματα υπόφυσης χρυσόψαρου τα οποία εκτέθηκαν (για ορισμένο χρονικό διάστημα) σε συγκεκριμένες συγκεντρώσεις αναλόγου. 2. Έλεγχος δεσμευτικής ικανότητας των αναλογών της GnRH στον υποδοχέα θηλαστικού. Χρησιμοποιήθηκε η υπόφυση ποντικιού. 3. Πειράματα in vivo σε μεσογειακά είδη ψαριών (τσιπούρα, κέφαλο, λαβράκι, συναγρίδα). 4. Έλεγχος της δράσης σε καρκινικές σειρές κυττάρων. Χρησιμοποιήθηκαν κύτταρα από κακοήθεις όγκους ασθενών με καρκίνο του μαστού και ωοθηκών. Από τα αποτελέσματα των βιολογικών πειραμάτων προέκυψε ότι από τα ανάλογα που συντέθηκαν κάποια έχουν ισχυρή αγωνιστική δράση και μπορούν να χρησιμοποιηθούν στις ιχθυοκαλλιέργειες για αύξηση της αναπαραγωγής αλλά και να δοκιμαστούν σε πειράματα με στόχο τον ανθρώπινο οργανισμό τόσο στο επίπεδο της αναπαραγωγής όσο και στην θεραπεία αρκετών μορφών καρκίνου.