Σχεδιασμός και σύνθεση αναλόγων επίτοπων της μυελίνης καθώς και αναλόγων της β αλυσίδας του υποδοχέα της ιντερλευκίνης - 2: μελέτη δομής-βιολογιής δραστικότητας

Abstract

In this thesis the synthesis of linear and cyclic peptide analogues based on the Myelin Protein epitope, is reported. Specifically, linear and cyclic analogues based on MBP1-11 and PLP 139-151 epitopes were synthesized. Also, peptide analogues based on the extracellular domain of the IL-2Rβ chain were synthesized. The scope was the structure activity studies of these peptides.The cyclic peptides present better stability, selectivity of the receptor and biovailability compared to linear analogues. The synthesis of these analogues (linear and cyclic) was achieved using the 2-chlorotritylchloride resin, which was combined with Fmoc/tBu methodology. The Nα groups of amino acids were protected by Fmoc group and DIC/HOBt were used as reagents for the activation of the carboxyl group. For the cyclization of peptides the TBTU/HOAt and collidine base, were used. The above reagents provoked fast, quantitative reactions without side products even in peptides with 22 AA in their chain. The purity of products was verified by RP-HPLC and their identification by ESI-MS. Some of the analogues were tested for their ability to induce or inhibit EAE on SJL mice. The IL-2Rβ chain analogues were tested for their ability to prevent binding of IL-2 and inhibit the proliferation and cytokine secretion of mitogen-stimulated peripheral blood Τ -cells. PHA-induced Τ-cell proliferation was significantly inhibited by the Μ1Ο7-Ε118 peptide. Cell counting revealed a reduction of the PBMC populations by 27,95% and a reduction of the lymphocyte populations by 37,59%. The amount of IL-2 in the culture supernatants was decreased by 56,69%. Given that IL-2 is produced by antigen activated Τ -cells, its reduction reflects a suppression of activated Τ -cells, and this was also confirmed by immunophenotyping.

Στα πλαίσια της παρούσας διατριβής έγινε η σύνθεση πεπτιδικών αναλόγων επιτόπων πρωτεΐνών της Μυελίνης. Συγκεκριμένα συντέθηκαν γραμμικά και κυκλικά ανάλογα των επιτόπων ΜΒΡ1-11 και PLP139-151 καθώς και πεπτιδικών αναλόγων της β-αλυσίδας του υποδοχέα της IL-2 με σκοπό τη μελέτη της σχέσης δομής-βιολογικής δραστικότητας. Τα κυκλικά πεπτίδια τα οποία, σύμφωνα με βιβλιογραφικά δεδομένα, είναι σταθερότερα σε σχέση με τα αντίστοιχα γραμμικά ανάλογα στα πρωτεολυτικά ένζυμα πολλές φορές έχουν και την βέλτιστη στο χώρο διαμόρφωση για αλληλεπίδραση με τον υποδοχέα. Η κυκλοποίηση των πεπτιδίων οδηγεί σε αυξημένη σταθερότητα, δραστικότητα, εκλεκτικότητα του υποδοχέα και βιοδιαθεσιμότητα με αποτέλεσμα μια καλύτερη φαρμακολογική εικόνα. Η σύνθεση όλων των αναλόγων (γραμμικών, κυκλικών) έγινε σε στερεά φάση επί της ρητίνης 2-χλωροτριτυλοχλωριδίου η οποία συνδυάζεται με την Fmoc/tBu μεθοδολογία με χρησιμοποίηση Να-Fmoc προστατευμένων αμινοξέων και DIC/HOBt αντιδραστήρια ενεργοποίησης καρβοξυλομάδας. Οι αντιδράσεις κυκλοποίησης των πεπτιδίων πραγματοποιήθηκαν με χρήση των αντιδραστηρίων ΤΒΤU/HOAt και ως βάση χρησιμοποιήθηκε η κολλιδίνη. Τα παραπάνω αντιδραστήρια έδωσαν γρήγορες, ποσοτικές αντιδράσεις χωρίς την δημιουργία παραπροϊόντων ακόμα και σε ανάλογα όπου η πεπτιδική αλυσίδα αποτελoύνταν από 22 αμινοξέα. Ο έλεγχος της καθαρότητας των προϊόντων έγινε με RP-HPLC και η ταυτοποίησή τους με ESI-MS. Μερικά από τα ανάλογα που συντέθηκαν δοκιμάστηκαν για την ικανότητά τους να προκαλούν ή να αναστέλλουν την εμφάνιση Πειραματικής Αυτοάνοσης Εγκεφαλομυελίτιδας (ΕΑΕ) σε SJL ποντίκια. Επίσης έγινε προσπάθεια μελέτης της επίδρασης αναλόγων της β-αλυσίδας του υποδοχέα της IL-2 όσο αφορά την ικανότητά τους να αναστέλλουν τον κυτταρικό πολλαπλασιασμό και την παραγωγή της IL-2. Παρατηρήθηκε αξιοσημείωτη αναστολή του επαγωμένου από το PHA Τ-κυτταρικού πολλαπλασιασμού παρουσία του πεπτιδίου M107- E118. Επίσης μείωση του πληθυσμού των περιφερικών μονοπύρηνων κυττάρων κατά 27.95% και ελάττωση του αριθμού των λεμφοκυττάρων κατά 37,59%. Το ποσό της μετρούμενης στα υπερκείμενα καλλιεργειών IL-2 έδειξε μείωση κατά 56,69%. Δεδομένου ότι η IL-2 παράγεται από αντιγόνο-ενεργοποιημένα Τ-κύτταρα, η ελάττωση της παραγόμενης ποσότητας της αντικατοπτρίζει μια αντίστοιχη καταστολή των ενεργοποιημένων Τ-κυττάρων, γεγονός που πιστοποιήθηκε και με τα αποτελέσματα της ανοσοφαινοτύπισης.