Μελέτη του μεταβολισμού και της δράσης του παράγοντα ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων σε ανθρώπινο νεφρικό ιστό και νεφρικά κύτταρα

Abstract

Platelet activating factor (PAF) is a potent inflammatory mediator that is produced by a variety of cells. It is biosynthesized either by remodeling pathway from membrane phospholipids either by de novo pathway of glyceryl-ether lipids. Remodeling pathway is activated in inflammatory conditions while de novo pathway produces PAF under physiological conditions. The study of PAF metabolism enzymes is of great important since they are responsible for pathological and physiological PAF levels. Several studies indicated PAF participation in the pathogenesis of many renal diseases. Glomerulosclerosis (GS) is the common pathological feature in most renal diseases and is highly correlated with the progression of renal failure. Although numerous attempts have been made to elucidate the mechanisms underlying glomerulosclerosis, the precise pathogenesis remains undetermined. GS and atherosclerosis are thought to share a common pathogenesis and the term ‘Glomerular atherosclerosis’ has been proposed. Unregulated intracellular lipid accumulation is thought to be critical step in the development of the two diseases and may happen through scavenger receptors or dysregulation of LDL receptors. The aim of the study is 1. To exam the enzyme acetyl-CoA:lyso-PAF acetyltransferase (lyso-PAF AT) of remodeling pathway in human kidney and mesangial cells. In order to do that yhe fraction of total membranes, from human renal tissue and from human mesangial cell line (HMC), was obtained and enzymatic activity was determined by trichloroacetic acid precipitation method. The optimal reaction conditions were estimated for lyso-PAF AT from HMC, more specific optimal temperature was 37οC, optimal pH 7.2-7.4 and concentrations of lyso-PAF and acetyl-CoA 20 μΜ and 200 μΜ respectively. The values of Κm (μΜ) and Vmax (nmol/min/mg) were determined with respect to lyso-PAF 45.2 ± 9.37, 9.37 ± 3.1 and with respect to acetyl-CoA 71.2 ± 15.1, 2.83 ± 0.252, respectively. High concentrations of Mg2+ and Ca2+ partly inhibit enzyme action. EDTA also inhibits the enzyme action and this inhibition is reversible with exogenous addition of Ca2+. BSA, Naf and pefabloc does not influence the activity while inhibition was observed with addition of DTT and mercaptoethanol. Various detergents were tested for the 189 solubilization of enzyme from human kidney and mesangial cells. Only glycerol successfully solubilaze the enzyme without inactivation. Solubilized fractions were successfully purified on HPLC with anion exchange column. Solubilazed fraction from human kidney and active fractions from HPLC from HMC were subjects in native-PAGE. Two active were arisen from both in region of MW 25-30 kDa and 65-80 kDa. 2. To investigate the mechanism of PAF implication in glomerulosclerosis and especially in mesangial cells function. In order to do that the effect of PAF in intracellular lipid accumulation and in activation of the pro-inflammatory transcription factor NF-kB was investigated. A single class of PAF receptor was identified with Kd = 17.5 nM and Βmax = 4.01 pmol/mg of cell protein. Morphological experiments reveal that LDL is able foam cell formation in the presence to cause that PAF (10-6 M). This formation is inhibited by heparin and by BN520121 ahile polyinosic acid did not affect it. In addition PAF (10-6 M) increase levels of LDLr mRNA within 2h (peaked in 12h) even in the presence of excess LDL suggesting that PAF overrides the sterol mediated regulation of LDLr. Lower concentration of PAF (10-9 M) increased the expression of SCr within 2h (peaked at 6h). The effect of various signal transduction inhibitors in PAF action was studied. Moreover PAF (10-9 & 10-6 M) caused NF-kB activation in mesangial cells within 0.5 h and this activation persisted for 24 h. In addition PAF increases mRNA of its receptor possible through activation of NF-kB since promotor 1 of PAFR was detected. This data suggests that PAF may contribute to the progression of renal injury by causing lipid accumulation and activation of pro-inflammatory transcription factor pathways in mesangial cells.

Ο Παράγοντας Ενεργοποίησης των αιμοπεταλίων (PAF) είναι ένας ισχυρός φλεγμονώδης παράγοντας λιποειδικής φύσης που παράγεται από πληθώρα διεγερμένων κυττάρων μέσω δυο πορειών. Η εξ’ υπαρχής πορεία (de novo) είναι υπεύθυνη για τα βασικά επίπεδα του PAF ενώ η πορεία ανασχηματισμού (remodeling) ενεργοποιείται σε καταστάσεις φλεγμονής. Η μελέτη των ενζύμων μεταβολισμού του PAF είναι σημαντική αφού αυτά καθορίζουν τα επίπεδα του σε παθοφυσιολογικές καταστάσεις. Πολλές μελέτες, συμπεριλαμβανομένου μελέτες σε πειραματόζωα, καλλιέργειες νεφρικών κυττάρων και κλινικές μελέτες, επισημαίνουν τον κύριο ρόλο του PAF στις νεφρικές παθήσεις. Η σπειραματοσκλήρυνση (GS) είναι το κοινό χαρακτηριστικό των περισσότερων νεφρικών παθήσεων και σχετίζεται άμεσα με τη εξέλιξη αυτών σε νεφρική ανεπάρκεια. Παρόλο τον μεγάλο αριθμό μελετών δεν έχει ακόμα διευκρινιστεί ο ακριβής μηχανισμός πρόκλησης της GS. Τα τελευταία χρόνια μια σειρά μελετών επισημαίνουν ότι η αθηροσκλήρυνση και η σπειραματοσκλήρυνση παρουσιάζουν κοινά ιστολογικά χαρακτηριστικά και έχει προταθεί ο όρος «σπειραματική αθηροσκλήρυνση». Από το εργαστήριο μας έχει προταθεί μηχανισμός εμπλοκής του PAF στην πρόκληση της αθηροσκλήρυνσης και δεδομένου της ομοιότητας ανάμεσα στις δυο νόσους ο μηχανισμός αυτός φαίνεται ότι βρίσκει εφαρμογή και στην GS. Η ανεξέλεγκτη ενδοκυτταρική συσσώρευση λιποειδών στο εσωτερικό των κυττάρων οδηγεί στον σχηματισμό αφρωδών και πιστεύεται ότι παίζει σημαντικό ρόλο στην εξέλιξη των δυο ασθενειών. Η συσσώρευση μπορεί να γίνει τόσο μέσω των εκκαθαριστών υποδοχέων για την τροποποιημένη LDL όσο και μέσω δυσλειτουργίας των υποδοχέων για την μη τροποποιημένη LDL. Σκοπός της εργασίας ήταν να μελετήσει: 1. Το ένζυμο ακετυλο-CoA:λυσο-PAF ακετυλοτρανσφεράση (λυσο-PAF AT), της remodeling πορείας βιοσύνθεσης του PAF, το οποίο ενεργοποιείται σε καταστάσεις φλεγμονής σε ανθρώπινο νεφρικό ιστό και καλλιέργειες μεσαγγειακών κυττάρων. Για το σκοπό αυτό απομονώθηκαν οι ολικές μεμβράνες από νεφρικό ιστό που προέρχεται από νεφρεκτομηθέντες ασθενείς και από καλλιέργειες κυτταρικής σειράς ανθρώπινων μεσαγγειακών κυττάρων (HMC) και μετρήθηκε η δραστικότητα της λυσο-PAF-AT με τη μέθοδο του τριχλωροξικού οξέος. Στην περίπτωση των HMC καθορίστηκαν οι βέλτιστες συνθήκες για τη δράση του ενζύμου συγκεκριμένα : βέλτιστη θερμοκρασία επώασης 37οC, βέλτιστο pH 7.2-7.4, βέλτιστη 187 συγκέντρωση λυσο-PAF και ακετυλο-CoA 20 μΜ και 200 μΜ αντίστοιχα. Στις βέλτιστες συνθήκες υπολογίστηκε το φαινόμενο Κm (μΜ) και Vmax (nmol/min/mg) 45.2 ± 9.37, 9.37 ± 3.1 ως προς τον λυσο-PAF και 71.2 ± 15.1, 2.83 ± 0.252 ως προς το ακετυλο-CoA,, αντίστοιχα. Τα ιόντα Μg 2+ , Ca 2+ σε μεγάλη συγκέντρωση προκαλούν μερική αναστολή του ενζύμου ενώ το EDTA προκαλεί αναστολή που μειώνεται με προσθήκη εξωγενούς Ca 2+. Η BSA, το NaF και το pefabloc δε επηρεάζουν σημαντικά τη δραστικότητα του ενζύμου, ενώ το DTT και η μερκαπτοαιθανόλη το αναστέλλουν. Για τη διαλυτοποίηση του ενζύμου από τις ολικές μεμβράνες τόσο από νεφρικό ιστό όσο και από HMC δοκιμάστηκαν διάφορα απορρυπαντικά. Μόνο η γλυκερόλη κατάφερε να διαλυτοποιήση το ένζυμο χωρίς να το απενεργοποιήσει με απόδοση περίπου 35 %. Το διαλυτοποιημένο κλάσμα καθαρίστηκε περαιτέρω σε στήλη ανιοανταλλαγής (HPLC). Στα κλάσματα της HPLC εντοπίστηκε ενζυμική δραστικότητα. Επίσης πραγματοποιήθηκε μη αποδιατακτική ηλεκτροφόρηση στο διαλυτοποιημένο κλάσμα από το νεφρικό ιστό και στα δραστικά κλάσματα από την HPLC στα HMC και βρέθηκαν δυο περιοχές με δραστικότητα λυσο-PAF AT σε περιοχές μοριακών βαρών 25-30 kDa και 65-80 kDa. 2. Η διερεύνηση της εμπλοκής του PAF στο μηχανισμό πρόκλησης και εξέλιξης της νεφρικής βλάβης και συγκεκριμένα στις λειτουργίες των μεσαγγειακών κυττάρων. Για το σκοπό αυτό χρησιμοποιήθηκε κυτταρική σειρά ανθρώπινων μεσαγγειακών κυττάρων. Ανιχνεύτηκε ένα είδος PAF υποδοχέα με Kd = 17.5 nM και Βmax = 4.01 pmol/mg πρωτεΐνης. Μορφολογικά παρατηρήθηκε ότι η LDL παρουσία αντιοξειδωτικών και PAF 10-6 M μπορεί να σχηματίσει αφρώδη κύτταρα. Η δημιουργία των αφρωδών κυττάρων οφείλεται στις συγκεκριμένες συνθήκες σε δράση των υποδοχέων της LDL αφού αναστέλλεται από την ηπαρίνη, που μπλοκάρει τους LDL υποδοχείς, και από το BN52021 που είναι αναστολέας του PAF, ενώ δεν επηρεάζεται από το πολυϊνοσικό οξύ που μπλοκάρει τους εκκαθαριστές υποδοχείς. Τα παραπάνω ενισχύονται αφού PAF 10-6 Μ προκαλεί αύξηση στα επίπεδα mRNA του υποδοχέα LDL στις 6-12 ώρες επώασης ενώ επιπλέον ο PAF φαίνεται ότι υπερκαλύπτει την επαγόμενη καταστολή στα επίπεδα του mRNA του υποδοχέα LDL από τα υψηλά επίπεδα χοληστερόλης. Επιπλέον ο PAF αυξάνει τα επίπεδα του εκκαθαριστή υποδοχέα SRAI με μέγιστη αύξηση να παρατηρείται σε συγκέντρωση 10-9-10-10 Μ PAF και στις 6-24 ώρες επώασης. Ο ίδιος ο PAF σε συγκέντρωση 10-6-10-11 Μ προκαλεί θετική ρύθμιση του υποδοχέα του σε 6 ώρες επώασης, ενώ και τα δύο είδη υποκινητών, που ελέγχουν τη μεταγραφή του υποδοχέα του PAF, ανιχνεύτηκαν στα μεσαγγειακά κύτταρα. Επιπλέον ο PAF (10-6 και 10-9 Μ) ενεργοποιεί τον μεταγραφικό παράγοντα NF-κΒ μέσα σε 30 λεπτά. Αφού ο υποκινητής 1 περιέχει αλληλουχία δέσμευσής του NF-κΒ είναι πιθανό η θετική ρύθμισή στον υποδοχέα του να γίνεται μέσω του NF-κΒ. Τα στοιχεία αυτά υποδηλώνουν ότι ο PAF παίζει σημαντικό ρόλο στην πρόκληση και εξέλιξη της νεφρικής βλάβης μέσω του σχηματισμού μεσαγγειακών αφρωδών κυττάρων και την ενεργοποίηση του μεταγραφικού παράγοντα NF-κΒ.