Το μεταθετό στοιχείο Minos: ενεργότητα και εφαρμογές σε έντομα και θηλαστικά

Abstract

The transposable element Minos, originally identified in Drosophila hydei, belongs to the mariner/Tc1 superfamily of transposable elements, members of which, some active, some not, have been found in insects, in nematodes, in fish and in mammals. Several members of the superfamily retain the ability to transpose, even in hosts evolutionary distant from the elements original host, with the only prerequisite being the presence of active transposase, the enzyme that catalyzes the transposition. The present study shows that Minos, being a Dipteran element, is capable of precise excision and transposition from one extrachromosomal site to another, in cell lines of another Dipteran, mosquito Aedes aegypti, as well as of the Lepidopteran Spodoptera frugiperda. The excision and transposition events are monitored using interplasmid excision and transposition assays. The advantage of these assays lies in the fact that they can be applied easily and fast in any host, provided a cell line of it is available in order to investigate the activity of Minosin its cells. As shown in the present study, the Minos transposable element is also able to transpose in the genome and stably transform human cells. The precision and efficiency of transposition in human cells confirms the hypothesis that transposition of the members of the superfamily is not subject to limitations other than the presence of their transposase. Taking advantage of the ability of Minosto carry exogenous DNA, we devised vectors which allow the trapping of constitutively active genes in human cells. The efficiency of transposition and the number of insertions were sufficient to allow tagging all expressed genes in human cells and thus proves Minos to be a useful tool for functional genomics in mammals as well as in insects.

Το μεταθετό στοιχείο Minos, που ανακαλύφθηκε στη Drosophila hydei, ανήκει στην υπέρ-οικογένεια των μεταθετών στοιχείων mariner/Tc1, μέλη της οποίας, ενεργά ή μη, συναντώνται στα έντομα, στο νηματώδη σκώληκα, στα ψάρια και στα θηλαστικά. Αρκετά μέλη της υπέρ-οικογένειας διατηρούν την ικανότητα να μετατίθενται, ακόμα και σε ξενιστές εξελικτικά απομακρυσμένους από αυτόν στον οποίο αρχικά βρέθηκαν, με μοναδική προϋπόθεση την ύπαρξη ενεργού τρανσποζάσης, του ενζύμου που καταλύει την αντίδραση της μετάθεσης. Η παρούσα διατριβή δείχνει ότι το προερχόμενο από Δίπτερο μεταθετό στοιχείο Minos μπορεί να μετατίθεται από εξωχρωμοσωμικές θέσεις σε νέες, επίσης εξωχρωμοσωμικές, θέσεις στις κυτταρικές σειρές Mos20 του Διπτέρου κουνουπιού Aedes aegypti, και SF9 του Λεπιδόπτερου Spodoptera frugiperda. Τα γεγονότα εκτομής και μετάθεσης του στοιχείου ανιχνεύονται μέσω δοκιμασιών (assays) διαπλασμιδιακής εκτομής και μετάθεσης που εφαρμόζονται στα κύτταρα του ξενιστή. Το πλεονέκτημα των δοκιμασιών έγκειται στο γεγονός ότι μπορούν να εφαρμοστούν με ταχύτητα και ευκολία σε οποιοδήποτε ξενιστή με σκοπό την διερεύνηση της ενεργότητας του Minos στα κύτταρα αυτού. Όπως αποδεικνύεται από την παρούσα διατριβή, το μεταθετό στοιχείο Minos είναι ικανό να μετατίθεται στο γονιδίωμα ανθρωπίνων κυττάρων και να τα οδηγεί σε μόνιμο μετασχηματισμό. Η ακρίβεια και η αποτελεσματικότητα της μετάθεσης στα ανθρώπινα κύτταρα επιβεβαιώνει την υπόθεση ότι η μετάθεση των στοιχείων της υπερ-οικογένειας mariner/Tc1 δεν υπόκειται σε περιορισμούς άλλους από την παρουσία της τρανσποζάσης τους. Αξιοποιώντας την ικανότητα του στοιχείου να μεταφέρει εξωγενές γενετικό υλικό, δημιουργήθηκαν φορείς οι οποίοι επέτρεψαν την παγίδευση συστατικά εκφραζόμενων γονιδίων. Η συχνότητα μετάθεσης και ο αριθμός των ενθέσεων είναι συγκρίσιμος με αυτόν που απαιτείται για τη μέχρι κορεσμού μεταλλαξιγένεση του ανθρώπινου γονιδιώματος και καθιστά το μεταθετό στοιχείο Minos ένα πολύ χρήσιμο εργαλείο για Λειτουργική Γενωμική και στα θηλαστικά.