ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΣΕ ΕΝΔΟΣΠΕΡΜΙΟ ΚΑΛΑΜΠΟΚΙΟΥ - ΑΠΟΜΟΝΩΣΗ ΚΑΙ ΜΕΛΕΤΗ ΙΔΙΟΤΗΤΩΝ ΤΡΙΩΝ ΤΥΠΟΥ Ι ΚΑΙ ΜΙΑΣ ΤΥΠΟΥ ΙΙ ΚΙΝΑΣΕΩΝ ΚΑΖΕΙΝΗΣ

Abstract

ΕΞΕΤΑΣΘΗΚΕ Η ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΤΙΚΗ ΙΚΑΝΟΤΗΤΑ ΚΑΙ Η ΕΙΚΟΝΑ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ ΠΟΥ ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΝΟΝΤΑΙ ΚΑΤΑ ΤΗΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΤΟΥ ΕΝΔΟΣΠΕΡΜΙΟΥ ΚΑΛΑΜΠΟΚΙΟΥ. ΤΗΝ ΤΡΙΤΗ ΕΒΔΟΜΑΔΑ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΤΟΥ ΕΝΔΟΣΠΕΡΜΙΟΥ ΒΡΕΘΗΚΕ Η ΥΨΥΛΟΤΕΡΗ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑ ΤΩΝ ΚΙΝΑΣΩΝ ΚΑΖΕΙΝΗΣ ΚΑΙ Η ΕΝΤΟΝΟΤΕΡΗ ΕΝΔΟ ΓΕΝΗΣ ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΣΗ ΤΩΝ ΠΡΩΤΕΙΝΩΝ . ΤΡΕΙΣ ΚΙΝΑΣΕΣ ΚΑΖΕΙΝΗΣ ΤΟΥ ΤΥΠΟΥ Ι (CK-1B, CK-1Γ ΚΑΙ CK-1E) ΚΑΙ ΜΙΑ ΤΟΥ ΤΥΠΟΥ ΙΙ(CK-2Z) ΑΠΟΜΟΝΩΘΗΚΑΝ ΚΑΙ ΚΑΘΑΡΙΣΤΗΚΑΝ ΑΠΟ ΕΝΔΟΣΠΕΡΜΙΟ ΤΡΙΩΝ ΕΒΔΟΜΑΔΩΝ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ . Ο ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥΣ ΠΕΡΙΕΛΑΒΕ ΚΑΤΑΚΡΗΜΝΙΣΗ ΜΕ ΘΕΙΙΚΟ ΑΜΜΩΝΙΟ ΚΑΙ ΧΡΩΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΣΕ DEAE-ΚΥΤΤΑΡΙΝΗ , SEPHADEX G-75, ΗΠΑΡΙΝΗ-ΣΕΦΑΡΟΖΗ ΚΑΙ ΑΤΡ-ΑΓΑΡΟΖΗ. ΟΙ ΣΠΟΥΔΑΙΟΤΕΡΕΣΙΔΙΟΤΗΤΕΣ ΤΩΝ ΠΑΡΑΠΑΝΩ ΕΝΖΥΜΩΝ ΕΙΝΑΙ ΟΙ ΑΚΟΛΟΥΘΕΣ Α) ΟΛΕΣ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝ MG++Η MN++ Β) ΤΑ CK-1B,CK1-Γ ΚΑΙ CK-1E ΕΝΖΥΜΑ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΟΥΝ ΑΠΟΚΛΕΙΣΤΙΚΑ ΑΤΡ ΕΝΩ ΤΟ CK-2Z ΕΝΖΥΜΟ ΑΤΡ ΚΑΙ GTP ΩΣ ΔΟΤΗ ΦΩΣΦΟΡΙΚΩΝ Γ) ΤΑ CK-1B ΚΑΙ CK-1E ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΝΟΥΝ ΣΕΡΙΝΗ ΕΝΩ ΤΑ CK-1Γ ΚΑΙ CK-2Z ΣΕΡΙΝΗ ΚΑΙ ΘΕΟΝΙΝΗ Δ) ΤΑ CK-1B ΚΑΙ CK-1E ΣΥΓΚΡΑΤΙΟΥΝΤΑΙ ΑΠΟ ΣΤΗΛΗ ΑΤΡ-ΑΓΑΡΟΖΗΣ ΕΝΩ ΤΑ CK-1B ΚΑΙ CK-2Z ΔΕΝ ΣΥΓΚΡΑΤΙΟΥΝΤΑΙ Ε) ΣΕ IN SITU ΦΩΣ ΦΟΡΥΛΙΩΣΗ ΤΑ CK-1B ΚΑΙ CK1-Γ ΕΜΦΑΝΙΖΟΥΝ ΔΙΠΛΗ ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΜΕΝΗ ΖΩΝΗ (35-37 KDA) ΕΝΩ ΤΑ CK-2Z ΚΑΙ CK-1E ΜΙΑ (36KDA) ΣΤ) Η ΗΠΑΡΙΝΗ ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΖΕΙ ΙΣΧΥΡΑ ΤΗ ΔΡΑΣΗ ΤΟΥ CK-2Z ΕΝΩ Η ΔΡΑΣΗ ΤΩΝ CK-1B,CK1-Γ ΚΑΙ CK-1E ΕΙΝΑΙ ΑΝΕΠΗΡΕΑΣΤΗ Ζ) ΤΑ CK-2Z ΚΑΙCK-1E ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΝ ΟΥΝ IN VITRO ΤΙΣ ΥΨΗΛΕΣ ΚΙΝΗΤΙΚΟΤΗΤΑΣ (HMG) ΠΡΩΤΕΙΝΕΣ ΑΠΟ ΕΝΔΟΣΠΕΡΜΙΟ ΚΑΛΑΜΠΟΚΙΟΥ ΜΕ ΔΙΑΦΟΡΕΤΙΚΟ ΠΡΟΤΥΠΟ , ΑΝΤΙΘΕΤΑ ΤΑ CK-1B ΚΑΙ CK-1Γ ΔΕΝ ΤΙΣ ΦΩΣΦΟΡΥΛΙΩΝΟΥΝ.

THE PROTEIN PHOSPHORYLATION ACTIVITYAND THE PATTERN OF PHOSPHORYLATED PROTEINS OF MAIZE ENDOSPERMS WERE INVESTIGATED. THE HIGHER CASEIN KINASE ACTIVITY AND TH HIGHER PROTEIN ENDOGENOUS PHOSPHORYLATION WERE FOUND IN THREE WEEKS OLD ENDOSPERMS. THREE CASEIN KINASES OF TYPE I (CK-1B,CK-1Γ CK-1E) AND ONE OF TYPE II(CK-2Z) WERE ISOLATED AND PURIFIED FROM THREE WEEK OLD MAIZE ENDOSPERM BYA SERIES OF STEPS INCLUDING AMMONIUM SULFATE PRECIPITATION, DEAE-CELLULOSE, SEPHADEX G-75, HEPARIN-SEPHAROSE AND ATP-ARAGOSE C HROMATOGRAPHY. THE MOST IMPORTANT PROPERTIES OF THE ABOVE KINASES WERE THE FOLLOWING : A) THEY ALL UTILIZE MG++/MN++ B) THE CK-1B,CK-1Γ AND CK-1E ENZYMES UTILISED EXCLUSIVELY ATP WHILE CK-2Z EQUALLY WELL ATP/GTP C) THE RESIDUE(S) PHOSPHORYLATED IN CASEIN B Y CK-1B OR CK-1E WAS SERINE AND BY CK-1Γ OR CK-2Z SERINE AND THEONINE D) CK-1BAND CK-1E COULD BIND ON ATP -AGAROSE , BUT NOT CK-1Γ AND CK-2Z E) BY USING THE PROCEDURE OF IN SITU PHOSPHORYLATION CK-1B AND CK-1Γ SHOWED A 35-37 KDA PHOSPHORYLATED POLYPEPTIDE DOUBLET WHILE CK-2Z AND CK-1E A SIGLET 36 KDA PHOSPHORYLATED BAND F) HEPARIN STRONGLY INHIBIED THE CK-2Z WHILE CK-1B, CK-1Γ AND CK-1E WERE INAFFECTED G) MAIZE HMG-PROTEINS WERE PHOSPHORYLATED IN VITRO IN ADIFFERENT PATTERN BY CK-2Z AND CK-1E, BY CONTRAST THEY WERE NOT PHOSPHORYLATED BY CK-1B AND CK-1Γ.