ΜΕΛΕΤΗ ΤΗΣ L-ΑΣΠΑΡΑΓΙΝΑΣΗΣ ΣΤΟ ΠΡΩΤΟΖΩΟ T. PYRIFORMIS

Abstract

L-ASPARAGINASE OF TETRAHYMENA PYRIFORMIS IS A MEMBRANE BOUND ENZYME. MOST OF ITS ACTIVITY ( 80%) IS ASSOCIATED WITH MICROSOMES AND THE REMAINING WITH THE PELLICLES. INTACT PROTOZOA CAN HYDROLYZE L- ASPARAGINE AT A RATIO OF 60 NMOLE/10 6 CELLS/HR WHILE THE INFLUX OF THIS AMINOACID IS ONLY 8 NMOLE/10 6 CELLS/HR. UPON THESE STUDIES L- ASPARAGINASE OF PELLICLES CAN BE CONSIDERED AS AN ECTOENZYME. L- ASPARAGINASE CAN BE SOLUBILIZED BY CHAOTROPIC AGENTS, N-BUTANOLE OR BY 0.1 M PHOSPHATE BUFFER PH 8.0 AFTER PRETREATMENT OF THE MICROSOMES WITH 2% W/VTRITON X-100. PURIFICATION OF L-ASPARAGINASE WAS ACHIEVED BY CHROMATOGRAPHY ON PHENYL-SEPHAROSE CL-4B AND SEPHAROSE 6B COLUMNS. THE SPECIFIC ACTIVITY OF THE PURIFIED L-ASPARAGINASE WAS 5.5 UNITS/MG PROTEIN AND THE PURIFICATION FACTORWAS AROUND 300. L-ASPARAGINASE SHOWS A MOLECULAR WEIGHT OF 230,000 DETERMINEDBY CHROMATOGRAPHY ON SEPHAROSE 6B COLUMN AND CONSISTS OF SIX SUBUNITS OF 39,000 MOLECULAR WEIGHT AS DETERMINED BY SDS ELECTROPHORESIS. THE KM OF THE ENZYMEIS 2.2 MM AND ITS ISOELECTRIC POINT IS 6.8. IT DOES NOT HYDROLYZE L-GLUTAMINENOR D-ASPARAGINE AND FROM THE ANALOGUES TESTED IT HYDROLYZES ONLY A- N-METHYL-D,L-ASPARAGINE, WHILE ANALOGUES WITH SUBSTITUENTS IN THE B- POSITION INHIBIT L-ASPARAGINASE ACTIVITY IN A COMPETITIVE MANNER. ITS OPTIMUM PH IS 8.6 IN 50 MMTIRS-HCL AND 1 MM B-MERCAPTOETHANOL. FROM THE IONS TESTED ONLY ZN2+ INHIBITS 50% THE ENZYME ACTIVITY AT A 20 MM CONCENTRATION. L-ASPARAGINASE ACTIVITY REACHES MAXIMUM VALUES AT THE STATIONARY PHASE OF GROWTH OF TETRAHYMENA PYRIFORMISAND FLUCTUATES UPON THE GROWTH CONDITIONS AND THE COMPOSITION OF THE MEDIUM.

Η L-ΑΣΠΑΡΑΓΙΝΑΣΗ ΤΗΣ T. PYRIFORMIS ΕΙΝΑΙ ΔΕΣΜΕΥΜΕΝΗ ΚΑΤΑ 80% ΠΕΡΙΠΟΥ ΣΤΙΣ ΜΕΜΒΡΑΝΕΣ ΤΟΥ ΕΝΔΟΠΛΑΣΜΑΤΙΚΟΥ ΔΙΚΤΥΟΥ ΚΑΙ ΚΑΤΑ 20% ΣΤΙΣ ΚΥΤΤΑΡΟΠΛΑΣΜΑΤΙΚΕΣ ΜΕΜΒΡΑΝΕΣ. ΑΘΙΚΤΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΕΠΩΑΣΜΕΝΑ ΣΕ ΦΥΣΙΟΛΟΓΙΚΕΣ ΣΥΝΘΗΚΕΣ ΕΠΩΑΣΗΣ ΥΔΡΟΛΥΟΥΝ ΤΗΝ L-ΑΣΠΑΡΑΓΙΝΗ ΜΕ ΤΑΧΥΤΗΤΑ 60 NMOLE/10 6 ΚΥΤΤΑΡΑ/HR. Η ΕΙΣΟΔΟΣ ΤΗΣ L-ΑΣΠΑΡΑΓΙΝΗΣ ΣΤΑ ΚΥΤΤΑΡΑ ΓΙΝΕΤΑΙ ΜΕ ΤΑΧΥΤΗΤΑ 8 NMOLE/10 6 ΚΥΤΤΑΡΑ/HR, ΕΝΩ ΤΟ L-ΑΣΠΑΡΑΓΙΝΙΚΟΟΞΥ ΔΕΝ ΜΕΤΑΚΙΝΕΙΤΑΙ ΜΕΣΑ ΑΠΟ ΤΗ ΜΕΜΒΡΑΝΗ ΑΘΙΚΤΩΝ ΚΥΤΤΑΡΩΝ ΤΗΣ T. PYRIFORMIS.ΜΕ ΒΑΣΗ ΤΙΣ ΠΙΟ ΠΑΝΩ ΠΑΡΑΤΗΡΗΣΕΙΣ Η L-ΑΣΠΑΡΑΓΙΝΑΣΗ ΤΗΣ T. PYRIFORMIS ΜΠΟΡΕΙ ΝΑ ΘΕΩΡΗΘΕΙ ΟΤΙ ΣΥΜΠΕΡΙΦΕΡΕΤΑΙ ΣΑΝ ΕΚΤΟΕΝΖΥΜΟ. Η L-ΑΣΠΑΡΑΓΙΝΑΣΗ ΜΠΟΡΕΙ ΝΑ ΔΙΑΛΥΤΟΠΟΙΗΘΕΙ ΜΕ ΧΑΟΤΡΟΠΙΚΑ ΑΛΑΤΑ, ΜΕ Ν-ΒΟΥΤΑΝΟΛΗ ΚΑΙ ΜΕ ΕΚΧΥΛΙΣΗ ΤΩΝ ΜΙΚΡΟΣΩΜΑΤΙΩΝ ΜΕ 0,1 Μ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΟ ΔΙΑΛΥΜΑ ΦΩΣΦΟΡΙΚΟΥ ΝΑΤΡΙΟΥ ΡΗ 8,0, ΑΦΟΥ ΠΡΟΗΓΟΥΜΕΝΩΣ ΤΑΜΙΚΡΟΣΩΜΑΤΙΑ ΚΑΤΕΡΓΑΣΤΟΥΝ ΜΕ 2% W/V TRITON X-100. ΠΑΡΑΠΕΡΑ Ο ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ ΕΓΙΝΕ ΜΕ ΧΡΩΜΑΤΟΓΡΑΦΙΑ ΣΕ ΣΤΗΛΗ ΨΕΥΔΑΓΧΙΣΤΕΙΑΣ ΦΑΙΝΥΛΟ-ΣΕΦΑΡΟΖΗ CL-4B ΚΑΙ ΣΕ ΣΤΗΛΗ ΜΟΡΙΑΚΗΣ ΔΙΗΘΗΣΗΣ ΣΕΦΑΡΟΖΗ 6-Β. Ο ΚΑΘΑΡΙΣΜΟΣ ΗΤΑΝ ΠΕΡΙΠΟΥ 300 ΦΟΡΕΣ ΚΑΙ Η ΕΙΔΙΚΗ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑ 5,5 ΜΟΝΑΔΕΣ/MG ΠΡΩΤΕΙΝΗΣ. Η L- ΑΣΠΑΡΑΓΙΝΑΣΗ ΕΧΕΙ ΜΟΡΙΑΚΟ ΒΑΡΟΣ 230.000, ΥΠΟΛΟΓΙΣΜΕΝΟ ΜΕ ΜΟΡΙΑΚΗ ΔΙΗΘΗΣΗ, ΚΑΙ ΑΠΟΤΕΛΕΙΤΑΙ ΑΠΟ ΥΠΟΜΟΝΑΔΕΣ, ΟΠΩΣ ΕΔΕΙΞΕ Η SDS ΗΛΕΚΤΡΟΦΟΡΗΣΗ, ΜΕ ΜΟΡΙΑΚΟ ΒΑΡΟΣ 39.000. Η ΚΜ ΤΟΥ ΕΝΖΥΜΟΥ ΕΙΝΑΙ 2,2 ΜΜ ΓΙΑ ΤΗΝ L-ΑΣΠΑΡΑΓΙΝΗ, ΕΝΩ ΤΟ ΙΣΟΗΛΕΚΤΡΙΚΟ ΤΟΥ ΣΗΜΕΙΟ 6,8. ΗL-ΑΣΠΑΡΑΓΙΝΑΣΗ ΔΕΝ ΥΔΡΟΛΥΕΙ ΤΗΝ L-ΓΛΟΥΤΑΜΙΝΗ, ΟΥΤΕ ΤΗΝ D-ΑΣΠΑΡΑΓΙΝΗ ΠΟΥ ΕΙΝΑΙΑΝΤΙΘΕΤΑ ΚΑΙ ΣΥΝΑΓΩΝΙΣΤΙΚΟΣ ΤΗΣ ΑΝΑΣΤΟΛΕΑΣ. ΑΠΟ ΤΑ ΣΥΝΘΕΤΙΚΑ ΑΝΑΛΟΓΑ ΠΟΥ ΔΟΚΙΜΑΣΤΗΚΑΝ ΥΔΡΟΛΥΕΤΑΙ ΜΟΝΟΝ Η Α-Ν-ΜΕΘΥΛΟ-D,L-ΑΣΠΑΡΑΓΙΝΗ, ΕΝΩ ΤΑ ΠΑΡΑΓΩΓΑ ΜΕ ΥΠΟΚΑΤΑΣΤΑΤΕΣ ΣΤΗ Β-ΘΕΣΗ ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΖΟΥΝ ΣΥΝΑΓΩΝΙΣΤΙΚΑ ΤΗΝ ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΔΡΑΣΗ. ΠΑΡΟΥΣΙΑΖΕΙ ΒΕΛΤΙΣΤΗ ΔΡΑΣΗ ΣΕ ΡΗ 8,6 ΟΤΑΝ ΣΑΝ ΡΥΘΜΙΣΤΙΚΟ ΔΙΑΛΥΜΑ ΧΡΗΣΙΜΟΠΟΙΕΙΤΑΙ 50 ΜΜTRIS-HCL. ΑΠΑΙΤΕΙ Β- ΜΕΡΚΑΠΤΟΑΙΘΑΝΟΛΗ ΣΕ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ 1 ΜΜ, ΟΧΙ ΟΜΩΣ ΚΑΙ ΚΑΠΟΙΟΜΕΤΑΛΛΟ, ΕΝΩ Η ΑΥΞΗΜΕΝΗ ΣΥΓΚΕΝΤΡΩΣΗ ΑΛΑΤΩΝ ΠΑΡΕΜΠΟΔΙΖΕΙ ΤΗΝ ΕΝΖΥΜΙΚΗ ΔΡΑΣΗ. ΟΙ ΜΕΤΑΒΟΛΕΣ ΤΗΣ ΣΥΣΤΑΣΗΣ ΤΟΥ ΘΡΕΠΤΙΚΟΥ ΥΛΙΚΟΥ ΑΝΑΠΤΥΞΗΣ ΤΩΝ ΠΡΩΤΟΖΩΩΝ ΕΠΗΡΕΑΖΟΥΝ ΤΗΝ ΕΙΔΙΚΗ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑ ΤΗΣ L-ΑΣΠΑΡΑΓΙΝΑΣΗΣ. ΑΝΑΠΤΥΞΗ ΣΕ ΘΡΕΠΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΠΟΥ ΕΧΕΙ ΔΙΑΠΙΔΥΘΕΙ, ΓΙΑ ΝΑ ΦΥΓΟΥΝ ΟΙ ΜΙΚΡΟΥ ΜΟΡΙΑΚΟΥ ΒΑΡΟΥΣ ΕΝΩΣΕΙΣ, ΕΧΕΙ ΣΑΝ ΑΠΟΤΕΛΕΣΜΑ ΤΗΝ ΕΛΑΤΤΩΣΗ ΤΗΣ ΕΙΔΙΚΗΣ ΔΡΑΣΤΙΚΟΤΗΤΑΣ ΣΕ 0,005 ΜΟΝΑΔΕΣ. Η ΕΠΑΝΑΦΟΡΑΤΗΣ ΣΤΑ ΚΑΝΟΝΙΚΑ ΕΠΙΠΕΔΑ (0,02 ΜΟΝΑΔΕΣ) ΜΠΟΡΕΙ ΝΑ ΓΙΝΕΙ ΜΕ ΤΗΝ ΠΡΟΣΘΗΚΗ ΜΙΓΜΑΤΟΣ ΑΜΙΝΟΞΕΩΝ, ΦΑΙΝΟΜΕΝΟ ΠΟΥ ΔΕΝ ΠΑΡΑΤΗΡΕΙΤΑΙ ΜΕ ΤΗΝ ΠΡΟΣΘΗΚΗ ΤΟΥ ΚΑΘΕ ΣΥΣΤΑΤΙΚΟΥ ΧΩΡΙΣΤΑ.