Ουδετερόφιλο και μεταβολικό-ενεργειακό περιβάλλον

Abstract

Type 2 diabetes mellitus (T2D) is a metabolic disease that represents a significant health problem with increasing prevalence worldwide. T2D is characterized by chronic inflammation and insulin resistance, and has been associated with higher risk of infections and impaired wound healing, features that commonly lead to serious complications and high mortality.Neutrophil extracellular traps (NETs), a key defensive mechanism of neutrophils, are involved in various non-infectious diseases, including T2D, and their pathogenic role is defined mainly by their disease-related protein load. NETosis in T2D is impaired leading to the delayed release of short-lived and unstable NETs, an impairment that has been implicated in increased susceptibility to bacterial infections and wound healing incapability.LL-37 is an antimicrobial peptide with an important role in defense against bacterial infections, expressed by various cell types including neutrophils. Recently, our group demonstrated that the macrolide antibiotic clarithromycin induces the formation of LL-37-bearing NETs with potent antimicrobial activity. LL-37 has been associated with wound healing as well, given that it promotes re-epithelialization and vascularization.Considering the antimicrobial and wound healing properties of LL-37 as well as its presence on NETs under certain inflammatory conditions, we investigated whether LL-37 is present on diabetic NET structures. Using immunofluorescence, we found that both neutrophils isolated from treatment-naive T2D patients with impaired glycemic control and those isolated from well-controlled T2D patients with good glycemic control spontaneously release decorated with LL-37 NETs.As a result, we next investigated the antimicrobial activity of LL-37-bearing diabetic NET structures. The experimental procedure was performed using bacterial strain E. coli NCTC 9001, which were cultured in the presence or absence of in vitro generated T2D NETs. Although decorated with the potent antimicrobial peptide LL-37, diabetic NETs had no inhibitory effect on bacterial growth, irrespective of whether they derived from treatment-naive or well-controlled patient’s neutrophils.Based on the above finding, we examined whether clarithromycin could restore the in vitro antibacterial activity of diabetic NET structures. Thus, E. coli NCTC 9001 cultures were performed in the presence of NETs generated by T2D neutrophils upon in vitro stimulation with clarithromycin. Only clarithromycin-induced NETs from neutrophils of well-controlled patients were able to significantly reduce bacterial growth and their antibacterial properties were significantly abrogated when NET-bound LL-37 was neutralized with anti-LL-37 antibody. These findings suggest that clarithromycin restores the in vitro antibacterial properties of NET structures in normoglycemic T2D patients, in an LL-37-dependent manner.Clarithromycin did not further enhance the ability of diabetic neutrophils to release NETs spontaneously, as assessed by MPO-DNA complex ELISA, but it significantly increased the LL-37 levels on well-controlled T2D NETs, as assessed by immunoblotting and LL-37 ELISA. Thus, our experimental data propose that the improved in vitro antibacterial activity of clarithromycin induced well-controlled T2D NETs could be attributed to the increased externalization of LL-37 on these NETs.Taking into account the increasing evidence that LL-37 promotes wound healing, we investigated whether decorated with LL-37 T2D NETs are implicated in wound healing process, as well as the effect of clarithromycin. The experimental procedure was performed by incubating human skin fibroblasts (SFs) with in vitro generated T2D NETs, spontaneously and upon induction with clarithromycin, in order to study the effect on the activation of SFs and their differentiation into myofibroblasts. Clarithromycin-induced NETs from neutrophils of well-controlled patients had a significant inductive impact on the activation and differentiation of SFs, which was attributed to the increased levels of LL-37 on these NETs. This assumption was further supported by our final finding that diabetic NETs are not decorated with IL-17, a protein which also promotes fibrotic activity of fibroblasts when decorating NETs, neither clarithromycin induces its expression.Concluding, this study suggests that clarithromycin could add further advantage to well-controlled T2D patients, by both enhancing antibacterial activity of neutrophils and improving wound healing capacity of fibroblasts, through upregulation of LL-37 on NET structures.

Ο σακχαρώδης διαβήτης τύπου 2 (type 2 diabetes mellitus - T2D) είναι μία μεταβολική νόσος, η οποία έχει αναδειχθεί σε ένα πολύ σοβαρό πρόβλημα υγείας στις μέρες μας με διαρκώς αυξανόμενη συχνότητα εμφάνισης. Χαρακτηρίζεται από χρόνια φλεγμονή και αντίσταση στην ινσουλίνη και έχει συσχετιστεί με επιρρέπεια σε λοιμώξεις και διαταραχή του μηχανισμού επούλωσης τραύματος, συνθήκες οι οποίες προκαλούν σοβαρές επιπλοκές και αυξάνουν τα ποσοστά θνησιμότητας.Τα εξωκυττάρια δίκτυα χρωματίνης των ουδετερόφιλων (neutrophil extracellular traps - NETs) αποτελούν βασικό μηχανισμό άμυνας έναντι των λοιμώξεων, όμως έχουν συσχετιστεί και με την παθογένεια διαφόρων μη λοιμωδών νοσημάτων, συμπεριλαμβανομένου του T2D. Ο ρόλος τους στην παθογένεια των διαφορετικών νοσημάτων καθορίζεται κατά κύριο λόγο από το πρωτεϊνικό τους φορτίο. Ο διαβήτης τύπου 2 χαρακτηρίζεται από μία κατά κάποιο τρόπο απορυθμισμένη ΝΕΤωση, στα πλαίσια της οποίας σχηματίζονται NETs με ασταθή δομή. Μάλιστα, η υπέρμετρη και συγχρόνως «ελαττωματική» ΝΕΤωση στον T2D έχει εμπλακεί στην επιρρέπεια σε βακτηριακές λοιμώξεις και στη διαταραχή του μηχανισμού επούλωσης τραύματος που συχνά χαρακτηρίζουν τους διαβητικούς ασθενείς.Η πρωτεΐνη LL-37 είναι ένα πεπτίδιο με αντιμικροβιακές ιδιότητες και βασικό ρόλο στην άμυνα του οργανισμού έναντι των βακτηριακών λοιμώξεων, το οποίο εκφράζεται από διαφορετικούς κυτταρικούς πληθυσμούς, ένας εκ των οποίων είναι τα ουδετερόφιλα. Πρόσφατη μελέτη του εργαστηρίου μας κατέδειξε ότι το ευρέως χρησιμοποιούμενο στην καθημερινή κλινική πράξη αντιβιοτικό κλαριθρομυκίνη επάγει την απελευθέρωση «διακοσμημένων» με LL-37 NETs, τα οποία φέρουν ισχυρές αντιμικροβιακές ιδιότητες. Επίσης, η πρωτεΐνη LL-37 έχει συσχετιστεί με το μηχανισμό επούλωσης τραύματος, καθώς επάγει την αγγειογένεση και τη φάση ανάπλασης του ιστού.Λαμβάνοντας υπόψιν την αντιμικροβιακή δράση της πρωτεΐνης LL-37 και τις ευεργετικές της ιδιότητες αναφορικά με την ικανότητά της να επάγει το μηχανισμό επούλωσης τραύματος, αλλά και το γεγονός ότι υπό φλεγμονώδεις συνθήκες απελευθερώνεται μέσω των NETs στον εξωκυττάριο χώρο, στα πλαίσια της παρούσας μελέτης διερευνήθηκε η πιθανή παρουσία της πρωτεΐνης LL-37 πάνω στα διαβητικά NETs. Με τη χρήση της τεχνικής του ανοσοφθορισμού, φάνηκε πως τόσο τα ουδετερόφιλα των υπεργλυκαιμικών ασθενών με ανεπαρκή γλυκαιμικό έλεγχο (treatment-naive) όσο και εκείνα των ευγλυκαιμικών ασθενών με επαρκή γλυκαιμικό έλεγχο (well-controlled) απελευθερώνουν «αυθόρμητα» NETs που είναι «διακοσμημένα» με την πρωτεΐνη LL-37.Στη συνέχεια, διερευνήσαμε την αντιμικροβιακή δράση των «διακοσμημένων» με LL-37 διαβητικών NETs. Συγκεκριμένα, βακτήρια του στελέχους E. coli NCTC 9001 καλλιεργήθηκαν υπό την παρουσία ή όχι in vitro παραχθέντων T2D NETs. Αν και «διακοσμημένα» με την πρωτεΐνη LL-37, τα διαβητικά NETs δεν είχαν καμία ανασταλτική επίδραση στην ανάπτυξη των βακτηρίων, ανεξαρτήτως αν προέρχονταν από τα ουδετερόφιλα treatment-naive ή well-controlled ασθενών.Με βάση αυτό το εύρημα, διερευνήσαμε αν η κλαριθρομυκίνη θα μπορούσε να αποκαταστήσει την αντιβακτηριακή δράση των διαβητικών NETs in vitro. Συνεπώς, πραγματοποιήθηκαν καλλιέργειες των βακτηρίων E. coli NCTC 9001 υπό την παρουσία NETs που παρήχθησαν από διαβητικά ουδετερόφιλα, μετά από in vitro διέγερσή τους με κλαριθρομυκίνη. Μόνο τα NETs που σχηματίστηκαν μετά από διέγερση με κλαριθρομυκίνη των ουδετερόφιλων well-controlled ασθενών περιόρισαν σημαντικά την ανάπτυξη των βακτηρίων, όμως η αντιβακτηριακή τους δράση περιορίστηκε σημαντικά όταν η προσδεδεμένη σε αυτά πρωτεΐνη LL-37 ανεστάλη με τη χρήση κατάλληλου αντισώματος. Αυτά τα ευρήματα υποδηλώνουν ότι η κλαριθρομυκίνη αποκαθιστά in vitro την αντιβακτηριακή δράση των NETs που απελευθερώνονται από ουδετερόφιλα ευγλυκαιμικών ασθενών, μία επίδραση η οποία φαίνεται να μεσολαβείται από την προσδεδεμένη στα NETs πρωτεΐνη LL-37.Η κλαριθρομυκίνη δεν επηρέασε την ικανότητα των διαβητικών ουδετερόφιλων να απελευθερώνουν «αυθόρμητα» NETs, όπως αξιολογήθηκε με τη χρήση της μεθόδου MPO-DNA complex ELISA, όμως αύξησε σημαντικά τα επίπεδα της προσδεδεμένης πάνω στα well-controlled NETs πρωτεΐνης LL-37, όπως διερευνήθηκε με τη χρήση των τεχνικών western blot και LL-37 ELISA. Συνεπώς, τα ευρήματά μας καταδεικνύουν ότι η ενισχυμένη in vitro αντιβακτηριακή δράση των επαγόμενων από κλαριθρομυκίνη well-controlled T2D NETs θα μπορούσε να αποδοθεί στα αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης LL-37 που «διακοσμεί» αυτά τα NETs.Λαμβάνοντας υπόψιν τις διαρκώς αυξανόμενες ενδείξεις στη βιβλιογραφία ότι η πρωτεΐνη LL-37 μπορεί να επάγει το μηχανισμό επούλωσης τραύματος, διερευνήσαμε αν τα «διακοσμημένα» με LL-37 T2D NETs εμπλέκονται στη διαδικασία επούλωσης τραύματος, αλλά και αν η κλαριθρομυκίνη θα μπορούσε να επιδράσει ευεργετικά. Συγκεκριμένα, ανθρώπινοι ινοβλάστες δέρματος καλλιεργήθηκαν υπό την παρουσία T2D NETs που παρήχθησαν in vitro «αυθόρμητα» ή μετά από διέγερση με κλαριθρομυκίνη, προκειμένου να μελετήσουμε την επίδρασή τους στην ενεργοποίηση και διαφοροποίηση των ινοβλαστών δέρματος σε μυοϊνοβλάστες. Τα επαγόμενα με κλαριθρομυκίνη NETs από ουδετερόφιλα well-controlled ασθενών είχαν σημαντική επαγωγική δράση στην ενεργοποίηση και τη διαφοροποίηση των ινοβλαστών, η οποία αποδόθηκε στα αυξημένα επίπεδα της πρωτεΐνης LL-37 που «διακοσμεί» αυτά τα NETs, καθώς περιορίστηκε σημαντικά όταν ανεστάλη η LL-37 με τη χρήση κατάλληλου αντισώματος. Το συμπέρασμα αυτό ενισχύεται περαιτέρω από το τελευταίο εύρημά μας, σύμφωνα με το οποίο τα NETs στο διαβήτη τύπου 2 δεν είναι «διακοσμημένα» με την πρωτεΐνη IL-17, μία πρωτεΐνη που είναι γνωστό ότι επίσης επάγει την ινωτική δραστηριότητα των ινοβλαστών όταν βρίσκεται πάνω σε NETs, αλλά ούτε και η κλαριθρομυκίνη επάγει την έκφρασή της.Συμπερασματικά, η παρούσα μελέτη καταδεικνύει πως η κλαριθρομυκίνη θα μπορούσε να ωφελήσει περαιτέρω τους ευγλυκαιμικούς ασθενείς με διαβήτη τύπου 2, ενισχύοντας την αποτελεσματικότητα των ουδετερόφιλών τους έναντι των βακτηριακών λοιμώξεων και συγχρόνως βελτιώνοντας την ικανότητα των ινοβλαστών τους για επούλωση τραυμάτων, μέσω αύξησης των επιπέδων της πρωτεΐνης LL-37 πάνω στα NETs.