Μελέτη της παθογενετικότητας των λοιμώξεων από Leptrospira spp. στα μικρά μηρυκαστικά

Abstract

The zoonotic disease leptospirosis was first recognized in 1886 as heamoragic fibrile disease of man. The cause, Leptospira spp., family Leptospiraceae and order Sprirochetales, was isolated a few years later from rodents and other animals. During the 100 years of fascinating research, became clear that the pathogen is very important not only for Public Health, but also the productivity of food producing animals. Animal (wild and domestic) infections maintain pathogenic serovars in nature, if climatic factors (humidity and temperature) are favorable causing new infection to other animals and accidental infections to man entering a contaminated environment. Between these animals are also small ruminants.Seroprevalence of small ruminats could reach 60%, if the environmental factors favor the pathogen, and the worldwide serotypes identified serologically are Autumnalis, Castellonis, Gripotyphosa, Icterohaemorrhagiae, Hardjo, Sejroe, Sermani and others. In Greece, very little was known about leptospirosis in general until 2002, when an attempt was made to research the infection. This attempt showed that seroprevalence was about 24.1% among small ruminant abortion cases compared to 11% from non-cases. These findings showed that the consequences from this infection are completely unknown in Greece, thus unknown is also the contribution of food producing animals to human cases.For the above reasons, we decided to study the pathogenicity of Leptospira spp in small ruminants, because these animal species produce the majority of food products in Greece. For this purpose, Peloponissos (Southern Greece) was chosen as the area of concern for the following reasons: 1.KE.E.L.P.NO has recorded prefectures of Ilia and Messinia among those recording the highest number of human clinical leptospirosis in Greece2.The prefectures belong to the Veterinary Laboratory of Tripolis, with which we had good working relationship and 3.In Peloponissos we had good relationship with many other veterinarians of the State Veterinary Agencies. After a wide review of the literature we decided that the stages for studying small ruminant leptospirosis should be,1. The determination of serotype prevalence and importance in the chosen area among small ruminant abortion case. This research was expected to give could evidence of the best areas for isolating pathogenic serotypes from small ruminants 2. The comparison of the findings with evidence of infection using the methods MAT and PCR 3. The in vitro comparative study of isolated strains in association to selected pathogenic determinants and 4. The association of findings with microscopic lesions possibly caused by the presence of the pathogen with the above chosen methods for studying the infection. For the first purpose 463 serum samples were collected from recently aborted sheep (289) and goats (174. The highest mean prevalence (30-35%) of the pathogen was detected in the border areas of Ilia and Messinia. The next stages of the current project focused to these areas. Serum samples and tissue were collected during slaughtering. Kidney tissue and serum samples from 110 animals were collected and examined with culture, serology using the method MAT, direct visualization of leptospirae after silver staining, PCR and hsitopathological examination of kidney tissue. Only tissue samples from 24 animals were cultured before the attempt was aborted due to negative results and unfavorable economic circumstances. Thus, the in vitro comparative study of isolated serotypes was impossible. The research, however, continued for meeting the remaining objectives. Histological examination was performed on 263 tissue samples (2-3/ animal) and 29 (26.36%) animals showed strong evidence of microscopic leasions comparable to those observedin in vivo studies. They were from light monocytosis to severe glomerulonephritis. Of the 29 cases, 17(58.6%) were also positive in ΜΑΤ, 21 (72.3%) in PCR and 16 (55.2%) in both methods. Twenty eight (25.4%) serum samples were positive to one or more serotypes having titers between 1/100 to 1/800. Most prevalent serotypes were Tarassovi (10 samples), Autumnalis (10 samples), Zanoni (6 samples) and others. The examination of tissue with the method PCR showed 38 (34.5%) positive tissue samples, a prevalence close to that of the MAT, but the method does not differentiate between serotypes. Researchers recommend, due to low sensitivity of isolation, a combination of MAT and PCR for confirming cases or studying lesions possibly caused by pathogenic seotrypes of Leptospira. Thus, it is concluded from the above that the detected serovars, mainly Tarassovi and Autumnalis, are pathogenic for small ruminants, the majority of which were sheep (98 animals) causing possibly permanent kidney damage and abortions. Hence this animal species is not just an accidental host of the pathogen. It can maintain infecting serovars in its environment putting at risk farmers and others in the same area. This first evidence from Greece, show that the State must form a National Agency to systematically study the pathogen in association to food producing animals and man.

Η ζωονόσος λεπτοσπείρωση, γνωστή από το 1886 ως αιμορραγική, εμπύρετη νόσος του ανθρώπου, οφείλεται σε παθογόνους οροτύπους του γένους Leptospira της οικογένεια των Leptospiraceae, της τάξης των Sprirochetales. Από την απομόνωση του παθογόνου πριν 100 χρόνια είναι γνωστό ότι δεξαμενή του στη φύση είναι τα ζώα. Αρχικά ενοχοποιήθηκαν για τη διασπορά του παθογόνου τα τρωκτικά. Όμως, με την πάροδο των δεκαετιών και λόγω της σημαντικότητας του παθογόνου στη Δημόσια Υγεία, διαφάνηκε ότι πολλά άλλα είδη ζώων ήταν φορείς του παθογόνου ή νοσούσαν από συγκεκριμένους οροτύπους. Μεταξύ αυτών των ζώων ήταν τα κατοικίδια (σαρκοφάγα και παραγωγικά), στα οποία η μόλυνση από το παθογόνο μπορεί να είναι από αφανής μέχρι θανατηφόρα κλινική.Οι επιπτώσεις από αυτά τα ζώα είναι πρώτον η διασπορά στη φύση του παθογόνου και δεύτερον, στην περίπτωση των παραγωγικών ζώων, οι επιπτώσεις στην παραγωγή (γαλακτοπαραγωγή και κρέας). Κατά την διάρκεια των πρόσφατων δεκαετιών, με την αύξηση του ερευνητικού ενδιαφέροντος για το γένος Leptospira, έχει φανεί ότι τα μικρά μηρυκαστικά είναι εξ ίσου ευπαθή με τα βοοειδή και τους χοίρους στη μόλυνση από το παθογόνο. Η οροθετικότητα στα διάφορα είδη ζώων και η διασπορά των διαφορετικών οροτύπων του παθογόνου επηρεάζονται από σημαντικούς παράγοντες, μεταξύ των οποίων σημαντικότερες είναι οι κλιματικές συνθήκες (υγρασία και θερμοκρασία). Όταν αυτές ευνοούν την παραμονή και τον πολλαπλασιασμό του παθογόνου στη φύση, προδιαθέτουν στην υψηλή οροθετικότητα και τη μεγάλη διασπορά οροτύπων. Η οροθετικότητα των μικρών μηρυκαστικών μπορεί να φτάσει το 60%, ενώ οι ορότυποι, που διεθνώς έχουν αναφερθεί, είναι οι Autumnalis, Castellonis, Gripotyphosa, Icterohaemorrhagiae, Hardjo, Sejroe, Sermani και άλλοι. Στην Ελλάδα μέχρι το 2002 το νόσημα στα ζώα είχε αναφερθεί ελάχιστα. Από το 2002 και μετά έγιναν αρκετές προσπάθειες προσδιορισμού της οροθετικότητας των μικρών μηρυκαστικών. Αυτές ανέδειξαν ότι η οροθετικότητα ήταν μέχρι περίπου 24,1% στα περιστατικά αποβολών και περίπου 11% στα φαινομενικά υγιή πρόβατα και αίγες. Από αυτές τις δημοσιευμένες αναφορές διαφαίνεται ότι η μελέτη της σημασίας του παθογόνου στην παραγωγικότητα των μικρών μηρυκαστικών στην Ελλάδα είναι παραμελημένη. Άγνωστη φάνηκε δε ότι ήταν και η σημασία αυτού του είδους ζώου στη Δημόσια Υγεία. Για τους ανωτέρω λόγους αποφασίστηκε να μελετηθεί ερευνητικά η παθογενετικότητα του γένους Leptospira στα μικρά μηρυκαστικά. Για το σκοπό αυτό επιλέχθηκε η Πελοπόννησος για τους εξής λόγους:Το ΚΕ.Ε.Λ.Π.ΝΟ έχει καταγράψει τους Νομούς Ηλείας και Μεσσηνίας μεταξύ αυτών με τη μεγαλύτερη εμφάνιση κρουσμάτων κλινικής λεπτοσπείρωσης στον άνθρωπο.1.Οι δύο νομοί εξυπηρετούνται από το Κτηνιατρικό Εργαστήριο Τρίπολης, με το οποίο υπήρχε δυνατότητα συνεργασίας και 2.Στην Πελοπόννησο υπήρχαν συναδελφικές σχέσεις, που ωφελούσαν την γόνιμη συνεργασία με τις κτηνιατρικές υπηρεσίες.Μετά από την εκτενή ανασκόπηση της κείμενης βιβλιογραφίας αποφασίστηκαν τα εξής στάδια για τη μελέτη της μόλυνσης των μικρών μηρυκαστικών από το γένος Leptospira:1. Η εκτεταμένη ανασκόπηση και δημοσιοποίηση της κείμενης βιβλιογραφίας με σκοπό την παροχή χρήσιμων πληροφοριών για μια λοίμωξη των ζώων, που θεωρείται νέο-αναδυόμενη στον άνθρωπο και είναι ελάχιστα μελετημένη στην Ελλάδα. Αυτός ο σκοπός πραγματοποιήθηκε με τη δημοσίευση Bisias et al., 2010α - Κεφάλαιο 2. 2. Η ανίχνευση της σημαντικότητας οροτύπων του γένους Leptospira, που αναγνωρίζονται ως εμπλεκόμενοι σε περιστατικά αποβολών μικρών μηρυκαστικών της Πελοποννήσου και η ανάδειξη των περιοχών υψηλού κινδύνου. Ο σκοπός αυτός επιτεύχθηκε με την δημοσίευση της εργασίας Bisias et al., 2010β - Κεφάλαιο 3.3. Η ανίχνευση του παθογόνου σε μολυσμένους ιστούς των προς μελέτη ειδών ζώων με μεθόδους εφικτές για τα πραγματικά δεδομένα της Ελλάδας. Μεταξύ αυτών στόχος ήταν κυρίως η απομόνωση του παθογόνου, ώστε να μελετηθούν συγκριτικά κάποιοι παράγοντες παθογένειας των οροτύπων του γένους Leptospira. Ο σκοπός αυτός έχει αποτελέσει την προς κρίση εργασία Bisias et al., 2014 - που έγινε αποδεκτή και 4. Η συσχέτιση των παρατηρούμενων μικροσκοπικών αλλοιώσεων του ιστού προτίμησης του παθογόνου, δηλαδή του νεφρικού, με τις ιδιότητες αναγνωρισμένων οροτύπων για κάθε είδος ζώου ξεχωριστά. Για την ανίχνευση της σημαντικότητας οροτύπων σε περιστατικά αποβολών και εντόπιση περιοχών με προοπτική μελέτης της παθογενετικότητας αυτών οροδιερευνήθηκαν 463 οροί αίματος από πρόβατα (289) και αίγες (174), που προήλθαν από όλη την Πελοπόννησο. Εντοπίστηκαν δύο περιοχές στα σύνορα των Νομών Ηλείας και Μεσσηνίας, όπου τα εξετασθέντα κοπάδια είχαν οροθετικότητα μεταξύ 30 και 35% και τίτλους αντισωμάτων πάνω από 1/800. Σε αυτές τις περιοχές εστιάστηκε το επόμενο στάδιο μελέτης της παθογενετικότητας του μικροοργανισμού. Από ζώα των περιοχών αυτών, που έφταναν σε δύο σφαγεία, έγινε συλλογή ορών αίματος και νεφρών για απομόνωση του παθογόνου, μελέτη των ιστών με τη μέθοδο της PCR και ιστολογικά και μελέτη των ορών με τη μέθοδο της ΜΑΤ. Συλλέχτηκαν 110 δείγματα ιστών ισάριθμων ζώων και 110 ορών. Δείγματα ιστών από 24 ζώα καλλιεργήθηκαν με ενδεδειγμένο βιβλιογραφικά τρόπο για την απομόνωση οροτύπων του παθογόνου και την in vitro συγκριτική μελέτη του. Η προσπάθεια διήρκησε 4 μήνες και διεκόπη επειδή ήταν αρνητικά τα αποτελέσματα και επέφεραν αστάθμητους παράγοντες οικονομικής υποστήριξης. Έτσι, συνεχίστηκε η μελέτη της παθογενετικότητας της μόλυνσης μόνο βάσει των αλλοιώσεων του ιστού των νεφρών. Δηλαδή με ιστολογική και ορολογική διερεύνηση, με την PCR και την απευθείας παρατήρηση του παθογόνου σε ιστούς για επιβεβαίωση της παρουσίας του παθογόνου στους προς διερεύνηση ιστούς. Ιστολογικά διερευνήθηκαν 263 ιστοτεμάχια (2-3 ζώα). Από τα 110 ζώα 29 (26,36%) είχαν μικροσκοπικά ευρήματα, που θεωρούνται συναφή με την πειραματική μόλυνση από παθογόνους οροτύπους του γένους Leptospira. Οι αλλοιώσεις που παρατηρήθηκαν ήταν μεικτές και χαρακτηρίζονταν από απλή μονοκυτταρική διήθηση μέχρι σοβαρή διάμεση ίνωση. Από τα ιστολογικά θετικά, 17(58,6%) ήταν επίσης θετικά στην ΜΑΤ, 21 (72,3%) στην PCR και 16 (55,2%) ήταν θετικά και στις δύο μεθόδους (Πίνακας 3 – Παράρτημα 1). Είκοσι οκτώ οροί αίματος (25,4%) ήταν θετικοί σε ένα η περισσότερους οροτύπους. Οι θετικοί τίτλοι ήταν 1/100 έως 1/800 και οι συχνότερα απαντώμενοι ορότυποι ήταν οι Tarassovi (10 οροί), Autumnalis (10 οροί), Zanoni (6 οροί) και άλλοι. Με την μέθοδο PCR βρέθηκαν θετικοί στο παθογόνο 38 (34,5%) από τους 110 ιστούς. Αν και τα ποσοστά θετικών πλησιάζουν τα αποτελέσματα της μεθόδου ΜΑΤ, η μέθοδος δυστυχώς δεν διακρίνει ορότυπους. Διάφοροι ερευνητές αναφέρουν, όμως, ότι λόγω των πολλαπλών προβλημάτων απομόνωσης του παθογόνου, που αντιμετωπίζουν ακόμη και έμπειρα ερευνητικά κέντρα, άρα λόγω έλλειψης ευαισθησίας της απομόνωσης, ο πιο αξιόπιστος τρόπος επιβεβαίωσης της μόλυνσης ή/και εξήγησης των ιστολογικών αλλοιώσεων είναι ο συνδυασμός της ΜΑΤ με την PCR. Βάσει αυτών, συμπεραίνεται από τα ανωτέρω ότι οι αλλοιώσεις των ιστών ήταν πιθανότατα αποτέλεσμα της παρουσίας του παθογόνου. Αυτό το εύρημα σε συνδυασμό με την υψηλή οροθετικότητα (24,9%), που παρατηρήθηκε στα περιστατικά αποβολών μικρών μηρυκαστικών, δείχνει ότι το γένος Leptospira επηρεάζει την παραγωγικότητα και καθιστά αυτά τα είδη ζώων σημαντικό κίνδυνο για τη Δημόσια Υγεία.Άρα, ως πρόβλημα η λεπτοσπείρωση των μικρών μηρυκαστικών απαιτεί συστηματικότερη μελέτη, αφού αυτά τα είδη ζώων αποτελούν την κύρια παραγωγή προϊόντων ζωικής προέλευσης στην Ελλάδα. Για ικανοποίηση του σκοπού αυτού απαιτείται η δημιουργία Εθνικού Φορέα μελέτης του γένους Leptospira στον άνθρωπο και τα ζώα, κυρίως τα παραγωγικά.